Экспресс-диагностирование- диагностирование по ограниченному числу параметров за заранее установленное время

Разное

Х ray лада: Отзывы о LADA XRAY, плюсы и минусы Лада Х-рей хэтчбек авто на сайте Autospot.ru

Содержание

Почему серийная «Лада XRAY» не похожа на концепт-кар 2012 года

Концепт был лучше! АвтоВАЗ всё испортил! Подобными комментариями несколько лет назад встретили предсерийный вариант хэтчбека «Лада XRAY». Почему серийная модель оказалась не похожа на эффектный концепт образца 2012 года и могло ли получиться иначе?

Современные модели «Лада Веста» и «Лада XRAY» вполне по праву находятся на верхних строчках хит-парада продаж в России. Создатели пошли по пути ведущих мировых производителей: связали разные модели общей дизайнерской стилистикой, под которую скоро «причешут» и «Гранту». И начинался этот процесс с концепт-каров, сначала поисковых, «общих», а потом и предсерийных.

Так что же представляют из себя эти красочные машины за традиционной стеклянной оградой и почему всё-таки стоит изучить информацию о концепте, а не включать «синдром Хатико» и страдать по «обманутым ожиданиям»?

Концепт-кар Lada XRAY, 2012 год

История современного вазовского стиля стартует в 2011 году, когда на АвтоВАЗ под начало президента Игоря Комарова пришёл титулованный британский дизайнер Стив Маттин, к тому моменту подаривший миру несколько автомобилей Volvo и Mercedes-Benz, включая легендарные модели SLR McLaren и Maybach. И уже через год, в августе 2012 года, на Московском автосалоне представили первый плод работы Маттина — Lada XRAY Concept.

Задача этой машины — продемонстрировать общую стилистику будущих моделей, о чём сам Маттин говорил в интервью. Не выкатить перспективную серийную машину, а показать, в каком ключе будут развиваться «Лады»! Ну а кроме того, концепт позволил АвтоВАЗу закрепить за собой первенство с икс-образным дизайном передка, ведь уехавший из Тольятти в Mitsubishi дизайнер примерно в то же время корпел над «апгрейдом» визуального языка японской марки в том же ключе.

Естественно, представить новые дизайнерские идеи нужно в лучшем свете, и концепт с этим прекрасно справился.

Замысловатые формы, сложный рисунок светодиодной светотехники, дорогие материалы отделки салона и многое другое. Никак не хуже, чем у других. Да и создавался макет по тем же технологиям, что и концепты Honda, Subaru, Kia, Hyundai, Porsche. И делали выставочный образец те же люди — специалисты итальянской студии Vercamodel Saro.

Сотрудники компании Vercamodel Saro у концепт-кара Lada XRAY, 2014 год

Если при взгляде на концепт кажется, что это почти готовая машина, просто «принаряженная» к выставке, значит, обман удался. Конструкция здесь совсем другая. Начинается всё с пенопластовой болванки на тележке с простым каркасом. От неё, как от заготовки скульптуры, отсекают всё лишнее… нет, не скульпторы, а точные пятикоординатные станки.

Потом вырезаются внутренние полости, включая пространство салона, в котором появляются сиденья на каркасе серийных, но заново обитые поролоном и кожей, а также передняя панель и обивки из модельной пены, обтянутые «притворяющейся» пластиком плёнкой. Стёкла на поверку совсем не стёкла, а плексиглас, да и внешние кузовные панели с металлом не знакомы: они выполнены из стеклопластика. Диски в буквальном смысле «слепили из того, что было»: у обычного диска срезают лишние части, а сверху лепят новый дизайн из модельного полимера.

Интерьер концепта Lada XRAY, 2012 год

А фары-то какое загляденье! Только это и не фары вовсе, а декоративные фонарики из светодиодов и матового пластика, созданные только для того, чтобы красиво светиться, но ни в коем случае не светить. Тем, кто хотя бы время от времени заглядывал в школу, понятно, что такая конструкция по определению не способна дать правильную светотеневую границу, а просто светит равномерно во все стороны.

Имитация фар на концепте

А как оно ездит? Да примерно так же, как светят «фары». По силовому агрегату здесь тоже сплошная унификация: маломощный электромотор в компании с механической коробкой да свинцово-кислотные аккумуляторы. Всё это нужно только для того, чтобы не пришлось каждый раз таскать макет руками.

Подвески в привычном понимании вообще нет, то есть здесь отсутствуют упругие элементы. Спереди, правда, есть телескопический элемент, похожий на амортизатор, но предназначен он всего лишь для изменения клиренса, чтобы можно было и спорткар сымитировать, и кроссовер. Сзади тем же самым заведуют пластины с прорезями и болты. «Фольксвагены» да «Шкоды», говорите, нынче жёсткие? Это вы ещё на концепт-карах не ездили.

Если бы концепт Lada XRAY 2012 года предназначался к выходу в серию с неизменным дизайном, автомобиль не потерялся бы на фоне лучших образцов мирового автопрома. Но ему такой судьбы изначально не готовили, не желая даже задумываться (а тем более объявлять) о том, с какой платформой можно его «подружить», какими моторами оснастить и когда запускать. В то время АвтоВАЗ считали производителем очень простых и, соответственно, дешёвых машин с качеством комплектующих в режиме свободного плавания, и столь резкий скачок в плане класса и цены без вариантов остался бы непонятым. Машина бы воспринималась как очередные «Жигули», но в другой оболочке, и просто не разошлась бы тем тиражом, который необходим для рентабельности производства. К тому же, это был трёхдверный «зализанный» хэтчбек, что ещё больше ограничивало возможную целевую аудиторию. И что делать? Идти вверх постепенно! И начать это движение предстояло двум будущим серийным автомобилям, наделённым новой дизайнерской ДНК…

Концепт-кар Lada Vesta, 2014 год

По плану, пойти в серийное производство они должны были в сентябре 2015 года и феврале 2016 года. Но в августе 2014 года проходил очередной Московский автомобильный салон, и на нём вазовцы решили показать новые модели, ведь на 2015 год крупных выставок не планировалось. И, так как до конвейера машинам было ещё далеко, а показывать собранные по обходным технологиям полуфабрикаты себе дороже, к публике вышли предсерийные концепты Vesta и… XRAY (XRAY Concept 2, если точнее).

И тут у многих, что называется, сломался мозг: мол, как это так, два года назад показывали совсем другое. «Упрощение!» «Обман!» «Да я уже деньги накопил, чтобы тот купить!» А интервью, пресс-релизы и официальные ролики читать и смотреть, конечно же, никто не стал. Ну или про них забыли. Самое главное — название одинаковое, а что там официальные лица говорили, неважно.

Концепт-кар Lada XRAY, 2014 год

В этот раз выставлялись автомобили, изначально и предназначенные для серийного производства. «Веста» — «главное блюдо», абсолютно новая конструкция на своей собственной платформе Lada B, выросшей из прототипа ВАЗ-2116 (проект С). XRAY — ещё один «ребёнок» глобальной платформы В0, а точнее, переработка хэтчбека Sandero Stepway. Но это всё было впереди.

А под софитами выставки оказались ближайшие родственники концепта XRAY 2012 года, сделанные в той же мастерской Vercamodel по той же технологии, но по внешности практически идентичные будущим товарным экземплярам, за исключением тех же поправок: огромные диски и красивые гирлянды вместо рабочей светотехники. Именно поэтому вопросы «а где взять такую оптику?» и «почему они такие жадные, что не пустили эти фары в серию?» могут вызвать только улыбку.

В итоге, как мы знаем, обе модели успешно стартовали и хорошо продаются. И всё-таки, если бы серийному хэтчбеку подобрали другое название вместо имени XRAY, это помогло бы избежать синдрома Хатико?

Автозапчасти Лада X-Ray

посмотреть в Автокаталоге посмотреть в Автокаталоге:
Амортизатор ВАЗ LADA X-Ray задний 1шт. АвтоВАЗ

Код товара: 586678

Амортизатор ВАЗ LADA X-Ray задний 1шт. АвтоВАЗ

Артикул: 562109913R Производитель АвтоВАЗ 562109913R

Код товара: 582367

Балка моста заднего ВАЗ LADA X-RAY АвтоВАЗ

Артикул: 8450022202 Производитель АвтоВАЗ 8450022202

посмотреть в Автокаталоге посмотреть в Автокаталоге:
Бампер ВАЗ LADA X-Ray задний некраш. под окраску АвтоВАЗ

Код товара: 478252

Бампер ВАЗ LADA X-Ray задний некраш. под окраску АвтоВАЗ

Артикул: 850220699R Производитель АвтоВАЗ 850220699R

org/Offer»>
посмотреть в Автокаталоге посмотреть в Автокаталоге:
Бампер ВАЗ LADA X-Ray передний некраш. под окраску АвтоВАЗ

Код товара: 561804

Бампер ВАЗ LADA X-Ray передний некраш. под окраску АвтоВАЗ

Артикул: 620228136R Производитель АвтоВАЗ 620228136R

Код товара: 471540

Бачок расширительный ВАЗ LADA Largus,X-Ray дв. ВАЗ АвтоВАЗ

Артикул: 8450009504 Производитель АвтоВАЗ 8450009504

посмотреть в Автокаталоге посмотреть в Автокаталоге:
Бачок расширительный ВАЗ LADA Vesta,X-Ray АвтоВАЗ
модели группы  
Lada Vesta 191110. Бачок расширительный посмотреть

Код товара: 475904

Бачок расширительный ВАЗ LADA Vesta,X-Ray АвтоВАЗ

Артикул: 8450006450 Производитель АвтоВАЗ 8450006450

Интернет: нет в наличии

посмотреть в Автокаталоге посмотреть в Автокаталоге:
Бачок расширительный ВАЗ LADA Vesta,X-Ray Пластик
модели группы  
Lada Vesta 191110. Бачок расширительный посмотреть

Код товара: 575717

Бачок расширительный ВАЗ LADA Vesta,X-Ray Пластик

Артикул: 8450006450 Производитель Пластик ОАО г.Сызрань 8450006450*

org/Offer»>
посмотреть в Автокаталоге посмотреть в Автокаталоге:
Буфер ВАЗ LADA X-Ray капота, задней двери АвтоВАЗ

Код товара: 585168

Буфер ВАЗ LADA X-Ray капота, задней двери АвтоВАЗ

Артикул: 908783861R Производитель АвтоВАЗ 908783861R

Код товара: 587650

Вал коленчатый ВАЗ-21177 Vesta, X-Ray двиг-1,8 АвтоВАЗ

Артикул: 211771005020 Производитель АвтоВАЗ 21177-1005020-00

Код товара: 585565

Вкладыши ВАЗ-2180 LADA Vesta, X-Ray коренные d+0. 0 (двиг.21179,21129)

Артикул: 21179-1000102-01 Производитель АвтоВАЗ 21179-1000102-01

Код товара: 585569

Вкладыши ВАЗ-2180 LADA Vesta, X-Ray коренные d+0.25 (двиг.21179,21129)

Артикул: 21179-1000102-10 Производитель АвтоВАЗ 21179-1000102-10

Код товара: 585564

Вкладыши ВАЗ-2180 LADA Vesta, X-Ray коренные d+0.5 (двиг.21179,21129)

Артикул: 21179-1000102-20 Производитель АвтоВАЗ 21179-1000102-20

org/Offer»>

Код товара: 519608

Вкладыши ВАЗ-2180 LADA Vesta, X-Ray шатунные d+0.00 (двиг.21179,21129)

Артикул: 21179-1000104-01 Производитель АвтоВАЗ 21179-1000104-01

Код товара: 585570

Вкладыши ВАЗ-2180 LADA Vesta, X-Ray шатунные d+0.25 (двиг.21179,21129)

Артикул: 21179-1000104-10 Производитель АвтоВАЗ 21179-1000104-10

Код товара: 585571

Вкладыши ВАЗ-2180 LADA Vesta, X-Ray шатунные d+0. 5 (двиг.21179,21129)

Артикул: 21179-1000104-20 Производитель АвтоВАЗ 21179-1000104-20

Код товара: 573170

Датчик кислорода RENAULT Logan2,Duster,NISSAN Almera(G15),ВАЗ LADA X-Ray,Vesta (дв.21179)

Артикул: POS057 Производитель PATRON POS-057

Интернет: нет в наличии

Код товара: 515886

Датчик кислорода RENAULT Logan2,Duster,NISSAN Almera(G15),ВАЗ LADA X-Ray,Vesta (дв.21179) OEM

Артикул: 226901841R(226A41772R) Производитель RENAULT 226901841R

org/Offer»>

Интернет: нет в наличии

Код товара: 592057

Датчик кислорода RENAULT Logan2,Duster,NISSAN Almera(G15),ВАЗ LADA X-Ray,Vesta (дв.21179) OEM

Артикул: 226906393R (226901841R/226A41772R) Производитель RENAULT 226906393R

посмотреть в Автокаталоге посмотреть в Автокаталоге:
Держатель ВАЗ LADA Vesta, X-Ray козырька АвтоВАЗ
модели группы  
Lada Vesta 584011. Поручни, козырьки, крючки посмотреть
Lada Vesta 584012. Поручни, козырьки, крючки посмотреть

Код товара: 583272

Держатель ВАЗ LADA Vesta, X-Ray козырька АвтоВАЗ

Артикул: 8450008061 Производитель АвтоВАЗ 8450008061

org/Offer»>

Код товара: 581220

Диск тормозной ВАЗ LADA VESTA X-Ray задний АвтоВАЗ 1шт

Артикул: 8450031131 Производитель АвтоВАЗ 8450031131

плюсы и минусы ВАЗ Lada XRAY

Итак, после 8 месяцев эксплуатации решил наконец написать свой отзыв.Краткая предыстория.За 16 лет стажа я сменил много машин. Начинал, как многие, с отечественного ВАЗа, потом были иномарки (новые и б/у). В последнее время предпочитаю автомат, т.к. для городской езды гораздо комфортнее. При приобретении автомобиля были следующие задачи:1) АКПП, т.к. и мне привычнее, а жена вообще на РКПП ездила только в автошколе2) Высокая посадка, т.к. иногда приходится заезжать на паребрики или ездить в лес за грибами-ягодами (это не самый главный критерий, но очень уж привыкли)3) Возраст а/м не старше 5-6 лет, что бы не ломалась через день на третий4) Бюджет — чем дешевле, тем лучше, но в пределах разумногоИсходя из поставленных задач начал поиск. После нескольких дней просмотра б/у авто понял, что за более менее приличный вариант надо выложить полмиллиона. Причём а/м будет не первой свежести, а надёжность никто не гарантирует. Тогда и взяло сомнение, что стоит посмотреть новый а/м. Вариантов было немного. Из всего просмотренного наиболее оптимальным по соотношению цена-качество показался X-Ray. Жену сперва в известность не ставил в виду её предвзятого отношения к отечественному автопрому. Съездил в один из автосалонов посмотреть самостоятельно. В салоне был только белый вариант в максимальной комплектации, и тот «уже продан». Ждать под заказ примерно месяца 2… Тем не менее авто посмотреть и «пощупать» удалось. Салон и внешний вид приятно порадовали. Робот изначально не пугал, т.к. опыт езды на роботе уже был. Убедившись, что а/м стоящий решил плавно подготовить жену к покупке. В итоге убедил её съездить посмотреть. Для осмотра выбрали уже другой автосалон. Там тоже для осмотра был только белый вариант в максимальной комплектации. Жене а/м понравился и начались переговоры по комплектации. Нам могли предложить только 2, либо базову, либо максимальную. Ни то ни другое не радовало. Базовая — откровенно пустая! Установить туда дополнительные опции дороже, чем сразу взять среднюю. А люксовая, на мой взгляд, неоправданно дорога, а дополнительные опции лично мне не особо нужны. Что кондей, что климат всё едино, полного привода всё равно нет, камера заднего вида интересно, но не за 50 же тысяч… Тут в игру вступили консультанты, которые стали нас убеждать, что других машин в городе нет и не будет, и только у них «случайно» осталось всего 2 а/м в базовой комплектации, а среднюю комплектацию мы всё равно не найдём… и т.д. и т.п. Машинкой загорелись, решили попробовать. Внесли предоплату и подали заявку на кредит. Пока ждали одобрения, на следующий день, жена решила посмотреть других дилеров. И, кто ищет, тот всегда найдёт, ей повезло. Ещё у одного дилера нашёлся Х-Ray в средней комплектации, да ещё и не белого, а красного цвета (этот цвет нам обоим понравился больше всего). Съездили, посмотрели и решили переиграть на этот вариант.В итоге взяли красный X-Ray в комплектации, которую и хотели. Дополнительно установил защиту двигателя, заказал коврики в салон и маркировку стёкол (от угона бывает помогает). больше ничего не делал.Из салона уехал с приключениями, т.к. до бензоколонки не дотянул. Бензина хватило на 300 метров. Позвонил в салон и консультант пришёл с бутылкой пластиковой и литром бензина. В бак бензин не долить, т.к. там стоит защита. Пришлось скрутить с крыши антену, ею отодвинуть защиту и заправить а/м.До заправки кое-как в итоге добрался, заправился и поехал дальше. По началу расстроил робот. До этого опыт общения с роботом был на Опеле Корса. Там он мне вполне понравился. Здесь всё оказалось иначе. На первых 3-х передачах переключение шло с рывком. При сильном нажатии на педаль газа передача «залипала»; на первой (чего на опеле не случалось) и, главное, не выходила из «бешеного режима»; до почти полной остановки и сброса оборотов до 1000 (примерно). Первые несколько дней было откровенно неприятно. Жена сев за руль вообще сказала, что она на этой машине ездить не сможет! Но ко всему привыкает человек. Через несколько дней мы с роботом адаптировались друг к другу. Нет, он не стал работать лучше, просто я понял принцип его работы и научился понимать последствия своих действий. Жена ездила меньше, потому привыкала дольше. Но тоже привыкла. На данный момент робот никаких проблем не доставляет. Работает прекрасно! Привыкли. Чуть тупит на старте и разгоне, но зная это просто спокойно рассчитываем свои действия. Зато и расход топлива ниже, чем при АКПП.В остальном машинка радует. В морозы греется достаточно быстро, в салоне тепло (и даже жарко). В жару кондиционер работает нормально (хотя я его и не люблю использовать, доводилось простужаться летом под кондеем). Бортовая электроника в норме. Не хватает только 2-х датчиков: температуры охлаждающей жидкости (о чём не писал только ленивый) и бачка омывателя. К счастью, у меня есть опыт эксплуатации Тойоты Рав4 во 2-м кузове. Там тоже датчика на бачок омывателя не было. Даже хуже, омывайка до последнего лила в полную силу, и никаких способой понять, что пора доливать, кроме открытия капота, не было. Так что не привыкать.В морозы свыше -20 замерзал бортовой компьютер. Начинал работать только после прогрева салона. Норма это или нет — не знаю… подозреваю, что нет, но особо не заморачиваюсь… 5 минут и в машине тепло.Проходимость хорошая, паребрики и сугробы проблем не доставляли не смотря на то, что привод только передний, хотя по бездорожью я и не экспериментировал.Попосадке машина удобная, хотя на дальние расстояния не ездили, но для перемещения по городу и поездок за город — самое то.Управляемость хорошая, руля слушается, разгон набирает бодро. Тормозит корректно. На дороге ведёт себя предсказуемо. Штатная летняя резина порадовала, хорошо держит дорогу даже при попадании в колею с водой во время ливня.Багажник вместительный. Есть ниша в запасном колесе и много места под фальш-полом.По посадке сзади немного тесновато, но у нас там ездят дети — им в самый раз. Ещё и ногами дрыгают :)В общем и целом достойное сочетание цены и качества. Отличный городской кроссовер (вполне на уровне Ниссана Кашкай, Рено Дастера). Правда, сделаю оговорку, машинка сборки времён Бу Андерсена. Он следил за качеством запчастей, на сколько я знаю.Так что для тех кто ищет спокойный семейный автомобиль с высокой посадкой, вместительным багажником, множеством опций и за разумные деньги — это достойный вариант.Если хотите рвать с места, соревноваться в скорости, ездить по бездорожью в снег и слякоть — тогда это не Ваш вариант :)Удачи на дорогах.

Dima V. • 19 января 2017

LADA XRAY | официальный дилер Лада Х Рей (Икс Рей) в Санкт-Петербурге


Новый LADA XRAY – компактный кроссовер, обеспечивающий максимальный комфорт от вождения, высокий уровень безопасности и уверенность при маневрировании. Он адаптирован к любым дорожным условиям и суровому климату. Концепцию модели нового поколения полностью отражает её название: «X» – кроссовер, «R» – отдых, «A» – активность, «Y» – молодость.

Модельный ряд LADA XRAY 2020-2021 года представлен базовой моделью и версией Cross с расширенными возможностями. Каждая модификация кроссовера создана для активного ритма жизни, для смелых и решительных людей, для покорения бескрайних просторов нашей страны.

Официальный дилер «ЛАДА-ЦЕНТР» предоставляет возможность купить автомобили XRAY в кредит, в лизинг и по системе «трейд-ин» на максимально выгодных условиях. Кроме того, мы осуществляем техническое и сервисное обслуживание, предлагаем индивидуальные программы кредитования и страхования, скидки и подарки в рамках действующих акций, а также широкий ассортимент оригинальных аксессуаров и дополнительного оборудования.

Записаться на тест-драйв кроссовера, уточнить варианты комплектации и цены на LADA XRAY 2020-2021 года в Санкт-Петербурге в наличии или задать любой другой интересующий вопрос можно, позвонив специалистам отдела продаж по многоканальному телефону или лично посетив один из наших дилерских центров.

XRAY в наличии
Спецпредложения


Салонов в России

Положительных отзывов

Авто в наличии

Page not found — автомануал заказ автокниг с доставкой в любую точку мира

НАШИ ПАРТНЕРЫ:

Любой современный легковой или грузовой автомобиль можно обслуживать и ремонтировать самостоятельно, в обычном гараже. Все что для этого потребуется – набор инструмента и заводское руководство по ремонту с подробным (пошаговым) описанием выполнения операций. Такое руководство должно содержать типы применяемых эксплуатационных жидкостей, масел и смазок, а самое главное – моменты затяжки всех резьбовых соединений деталей узлов и агрегатов автомобиля. Итальянские автомобили – Fiat (Фиат) Alfa Romeo (Альфа Ромео) Lancia (Лянча) Ferrari (Феррари) Mazerati (Мазерати) имеют свои конструктивные особенности. Также в особую группу можно выделить все французские машины – Peugout (Пежо), Renault (Рено) и Citroen (Ситроен). Немецкие машины сложные. Особенно это относится к Mercedes Benz (Мерседес Бенц), BMW (БМВ), Audi (Ауди) и Porsche (Порш), в чуть меньшей — к Volkswagen (Фольксваген) и Opel (Опель). Следующую большую группу, обособленную по конструктивным признакам составляют американские производители- Chrysler, Jeep, Plymouth, Dodge, Eagle, Chevrolet, GMC, Cadillac, Pontiac, Oldsmobile, Ford, Mercury, Lincoln. Из Корейских фирм следует отметить Hyundai/Kia, GM-DAT (Daewoo), SsangYong.

Совсем недавно японские машины отличались относительно низкой первоначальной стоимостью и доступными ценами на запасные части, но в последнее время они догнали по этим показателям престижные европейские марки. Причем это относится практически в одинаковой степени ко всем маркам автомобилей из страны восходящего солнца – Toyota (Тойота), Mitsubishi (Мицубиси), Subaru (Субару), Isuzu (Исудзу), Honda (Хонда), Mazda (Мазда или как говорили раньше Мацуда), Suzuki (Сузуки), Daihatsu (Дайхатсу), Nissan (Ниссан). Ну, а машины, выпущенные под японо-американскими брендами Lexus (Лексус), Scion (Сцион), Infinity (Инфинити), Acura (Акура) с самого начала были недешевыми.

 

Отечественные автомобили также сильно изменились с введением норм евро-3. лада калина, лада приора и даже лада нива 4х4 теперь значительно сложнее в обслуживании и ремонте.

что делать если машина не заводится, как зарядить аккумулятор, как завести машину в мороз. ответы на эти вопросы можно найти на страницах сайта и книг. представленных здесь же

Автомануал — от англ. manual — руководство. Пособие по ремонту автомобиля или мотоцикла. различают заводские руководства и книги , выпущенные специализированными автомобильными издательствами.

Cайт Автомануал не несет никакой ответственности за возможные повреждения техники или несчастные случаи, связанные с использованием размещенной информации.

Сверхвысокая эффективность FRET NaGdF4: Tb3 + -Роза Бенгальский биосовместимый нанокомпозит для применения в фотодинамической терапии с возбуждением рентгеновскими лучами

Механизм, опосредованный реактивными формами кислорода (ROS), является основной причиной эффективности фотодинамической терапии (PDT). Процедура PDT основана на каскаде синергетических эффектов между светом, фотосенсибилизатором (PS) и кислородом, что в значительной степени способствует пространственно-временному контролю лечения. Однако эта процедура также вызвала несколько нерешенных проблем на разных уровнях, особенно ограниченную глубину проникновения света, которая ограничивает традиционную ФДТ только поверхностными опухолями [[1], [2], [3]].Несмотря на использование ПС, возбуждаемого БИК [[4], [5], [6], [7]], или комбинации наночастиц с повышающим преобразованием (UCNP) с ПС [8,9] для активации препарата на более глубоких глубинах, свет может перемещаться в тканях менее чем на 1 см [10,11], чтобы сохранить достаточно энергии для терапии. Фотодинамическая терапия, индуцированная микроволновым излучением, была альтернативным способом лечения глубоко укоренившейся опухоли с помощью теплового эффекта и генерации синглетного кислорода для уничтожения раковых клеток с помощью тщательно подобранной микроволновой частоты и мощности, чтобы избежать теплового повреждения тканей, которое не вызывает радиационного повреждения организма [12, 13].В качестве альтернативы, новый метод ФДТ, называемый фотодинамической терапией с рентгеновским возбуждением (X-PDT), был описан Ченом и соавторами в 2006 году, чтобы преодолеть ледниковый барьер проникновения света и сделать возможной эффективную ФДТ при глубоко расположенных опухолях или опухолях большого объема [14 ]. Для реализации высокоэффективной рентгеновской ФДТ были введены люминесцентные наночастицы, возбуждаемые рентгеновским излучением (XLNP), в качестве среды для передачи энергии рентгеновского излучения на фотосенсибилизатор, поскольку используемый в клинических условиях PS не может эффективно поглощать рентгеновские лучи.

Различные нанокомпозиты XLNP и PS, такие как ZnS: Cu, Co [15], наночастицы фторида / оксида, легированные лантаноидами [[16], [17], [18], [19], [20], [ 21], [22], [23]] и SrAl 2 O 4 : Eu 2+ [10,24] в сочетании с псораленом [19], розовым бенгальским (RB) [16,17] , MC 540 [24] и протопорфирин IX (PPIX) [25], были исследованы для приложений X-PDT.Тем не менее, высокая доза рентгеновского излучения является основной проблемой, ограничивающей их дальнейшее применение in vivo и в клинической практике X-PDT. Для достижения умеренного эффекта от лечения ФДТ доза облучения, описанная в литературе, обычно составляла от 2 до 8 Гр [15,16,18,21, [24], [25], [26], [27], [28]] , что сопоставимо с тем, что используется для клинической лучевой терапии. Это неизбежно привело к серьезным побочным эффектам, таким как миелосупрессия, поражение зачатка селезенки и атрофия клубочков. Среди этих подходов высоколюминесцентный материал SrAl 2 O 4 : Eu 2+ в сочетании с MC540 показывает самую низкую дозу облучения 0.5 Гр для достижения умеренной противоопухолевой эффективности 60,2 ± 6,9% [24], что исключает многообещающие перспективы для малодозной Х-ФДТ. Однако такой нанокомпозит диаметром 407,4 — 152,5 нм дает низкую эффективность флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) из-за низкого количества полистирола, сопряженного на поверхности покрытия, вызванного малым отношением площади к объему. Для высокоэффективного X-PDT можно использовать XLNP уменьшенного размера, чтобы максимизировать загрузку PS. Высокоэффективные и биосовместимые нанокомпозиты, которые можно возбуждать более низкой дозой рентгеновского излучения, необходимы для исследования in vivo X-PDT.

Для достижения высокоэффективной и безопасной X-PDT необходимо управлять следующими факторами: (a) высокая эффективность квантового выхода XLNP при рентгеновском излучении в диапазоне поглощения фотосенсибилизатора, который зависит от состава частиц, кристалла структура и морфология, (б) большое количество конъюгации PS на поверхности XLNP и эффективная передача энергии от XLNP к PS через процесс FRET. Кроме того, (c) для приложений in vivo такой нанокомпозит должен быть нецитотоксичным и диспергируемым в воде.

Tb 3+ и широко используемый PS под названием Rose Bengal (RB) являются классической парой в исследовании X-PDT из-за скорости перекрытия спектра bravo и сверхвысокого коэффициента экстинкции 10 5 M -1 см -1 при 549 нм RB [16,17,20,23,29]. Tang et al. продемонстрировали наносистему X-PDT с использованием LaF 3 : Tb 3+ в сочетании с RB, с высокой эффективностью FRET до 85% [17]. Для люминесцентных применений, возбуждаемых рентгеновскими лучами, гадолиний, который имеет высокий коэффициент поглощения рентгеновских лучей по массе, считается сенсибилизатором рентгеновских лучей для эмиттеров лантаноидов [30,31].В частности, НП на основе фторида гадолиния менее 10 нм NaGdF 4 : Ln 3+ (Ln = лантаноидные элементы) считались одними из самых эффективных люминесцентных люминофоров из-за низкой энергии фотонов и ширины запрещенной зоны 9– 10 эВ, что может минимизировать вероятность безызлучательной релаксации и максимизировать квантовый выход люминесценции по сравнению с LaF 3 [32,33]. Учитывая превосходную химическую стабильность, биосовместимость, однородную морфологию и распределение по размерам NaGdF 4 : Ln 3+ , наносистема, которая синтезирует β-NaGdF 4 : Tb 3+ НЧ с RB, будет хорошим кандидатом для высокоэффективный X-PDT.

Основываясь на научных данных, установленных выше, в этой статье мы предложили простой и эффективный нанокомпозит с использованием β-NaGdF 4 : Tb 3+ сферических НЧ с загрузкой RB для приложения X-PDT (Схема 1) . Новые наночастицы β-NaGdF 4 : Tb 3+ размером менее 10 нм были синтезированы с помощью процесса соосаждения и сначала использовались для применения X-PDT. Сильная люминесценция, сверхмалый размер, монодисперсность и очень однородная морфология были охарактеризованы с помощью HR-TEM, EDX и XRD. При возбуждении рентгеновскими лучами наблюдалась оптимизированная интенсивная зеленая люминесценция, соответствующая переходу 5 D 4 → 7 F 5 Tb 3+ , которая идеально согласовывалась со спектром поглощения RB при 549 нм. После модификации поверхности NP 2-аминоэтилфосфоновой кислотой (AEP) для водной дисперсии и биосовместимости RB был ковалентно конъюгирован на поверхности NP, чтобы минимизировать расстояние передачи энергии и максимизировать эффективность FRET. Систематическое исследование 1 O 2 эффективности генерации, цитотоксичности, эндоцитозов, in vitro и in vivo X-PDT показало, что эффективное лечение может быть достигнуто путем возбуждения предложенного β-NaGdF 4 : Tb Нанокомпозит 3+ -RB.

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и FRET-спектроскопия одиночных молекул дают сильно расходящиеся представления о развернутом состоянии с низкой денатурантностью что химически развернутые полипептиды неизменно коллапсируют из расширенной случайной спирали до более компактных размеров по мере того, как концентрация денатуранта уменьшается. Напротив, исследования малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) показывают, что, по крайней мере, для однодоменных белков при ненулевых концентрациях денатуранта такое уплотнение может быть редким.Здесь мы исследуем это несоответствие, изучая белок L, белок, ранее изученный методом SAXS (при 5 ° C), который предложил фиксированные размеры в развернутом состоянии от 1,4 до 5 M гидрохлорида гуанидина (GuHCl), и с помощью smFRET (при 25 ° C). ), что предполагает, что, напротив, цепь сжимается на 15–30% в том же диапазоне денатуранта. Повторяя более раннее исследование SAXS при тех же условиях, которые использовались в исследованиях smFRET, мы наблюдаем мало, если вообще наблюдаем, свидетельств того, что развернутое состояние белка L сокращается по мере снижения концентрации GuHCl.Например, профили рассеяния (и, следовательно, форма и размеры), собранные в течение ~ 4 мс после разбавления до 0,67 М GuHCl, практически неотличимы от профилей, наблюдаемых в равновесии при более высоком денатуранте.

Таким образом, наши результаты доказывают, что несоответствие между SAXS и smFRET статистически значимо и что экспериментальные данные в пользу коллапса облигатного полипептида при низком денатуранте пока нельзя считать окончательными.

Графический реферат

Основные моменты

► Результаты smFRET предполагают, что развернутое состояние схлопывается при низком денатуранте.► SAXS предполагает, что развернутые состояния с низким и высоким денатурантом неразличимы. ► Недостаточное совпадение наборов данных исторически скрывает значимость этого несоответствия. ► Параллельные исследования одного белка при одном наборе условий подтверждают несоответствие.

Сокращения

smFRET

одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера

SAXS

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

GuHCl

гидрохлорид гуанидина

APS

Ключевые слова

CHESS

Cornell High Energy Synchrotron Source

гидрофобный коллапс

неспецифический

клубок-глобула

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Полный текст

Copyright © 2012 Elsevier Ltd.Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Динамическая настройка FRET в биосенсоре зеленого флуоресцентного белка

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кристаллическая структура Twitch-2B

Мы решили структуру с разрешением 2,5 Å (таблица S1A). Асимметричный блок состоит из двух мономеров (рис. S1A). Они представляют идентичные конформации отдельных доменов [среднеквадратичные отклонения (RMSDs) ниже 0,2 Å] и несколько иную междоменную конформацию (RMSD 0.992 Å), по-видимому, не собираясь как симметричный гомодимер. Их интерфейс (рис. S1B), покрывающий 630 Å 2 ( 11 ), на самом деле значительно меньше, чем интерфейс стабильного димера ( 12 ). Кроме того, данные малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) показывают, что в растворе Twitch-2B является мономерным (рис. S2). Поэтому мы сфокусируем наше описание здесь на мономере A. Кристаллическая структура показывает расположение донора и акцептора относительно минимального кальций-связывающего домена TnC, а также структуру оптимизированных линкеров (рис.1). Структура кальций-связывающего домена очень похожа на C-концевой глобулярный домен куриного TnC (RMSD 0,84 Å) ( 13 ), на структуру ЯМР, решенную ранее ( 8 ), и на структуру кальмодулина. (RMSD 1,08 Å) ( 14 ). Главные оси двух бочкообразных β-доменов флуоресцентного белка ориентированы почти под перпендикулярным углом друг к другу. Стволы β практически не контактируют друг с другом (рис. 2A) с очень маленькой общей границей раздела (150 Å 2 ).Интерфейсы минимального кальций-связывающего домена с mCerulean3 и cpVenus cd также относительно малы, покрывая только 257 и 351 Å 2 соответственно (см. Ниже). Взаимодействия в основном носят гидрофильный характер (рис. 2А).

Рис. 2 Структурные детали Twitch-2B.

( A ) Полярные взаимодействия между остатками минимального домена TnC, mCerulean3 и cpVenus cd показаны пунктирными линиями. Остатки показаны в виде палочек.( B ) Полярные взаимодействия, опосредованные остатками (показаны в виде палочек) от линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также взаимодействия между cpVenus cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) . ( C ) Гидрофобные взаимодействия между остатками (показаны в виде палочек) линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также линкером между cpVenus cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) с остатками (выделены серым цветом) из ядра минимального домена TnC.( D и E ) Крупный план области вокруг N532 Twitch-2B и мутанта N532F Twitch-2B (Twitch-6).

Линкер между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (V 232 ADA) образует спираль 3 10 , которая прочно удерживается на месте водородными связями основной цепи от V232 и S236 в mCerulean3 до E301 и E239 кальция. -связывающий домен (рис. 2Б). Далее линкер между кальций-связывающим доменом и cpVenus cd (P 305 IYPEL) образует полтора α-спиральных витка (рис.2, B и C), карбонилы основной цепи E309 и L310 образуют водородные связи с боковой цепью R551 (рис. 2B) cpVenus cd . Боковая цепь E309 также образует водородную связь с Y152 mCerulean3, плотно связывая три домена вместе. Остатки I306, Y307 и L310 этой короткой спирали участвуют в сети гидрофобных контактов (рис. 2C). Очевидно, что скрининг оптимальных линкеров ( 8 ) привел к последовательностям со спиральными элементами, очень хорошо интегрирующимися в структуру минимального домена TnC, в то время как эти линкеры удерживают на месте донорный и акцепторный домены в основном за счет полярных взаимодействий.

Расчет эффективности FRET на основе структуры

Структура предоставила важную информацию для расчетов FRET. Во-первых, расстояние между центрами масс флуорофоров составляет 3,65 нм (рис. 1B). Затем внутри структуры флуорофоры mCerulean3 и cpVenus cd выровнены в конфигурации «голова к голове». Таким образом, мы могли точно определить относительную ориентацию дипольных моментов флуорофоров (рис. 1C; см. Материалы и методы), которые доступны из расчетов теории функционала плотности ( 15 ).Используя эту объединенную информацию, мы вычислили коэффициент ориентации κ 2 , равный 1,98 (уравнение 1; Материалы и методы), и расстояние Ферстера, R 0 , 6,9 нм для mCerulean3 / cpVenus cd Пара FRET (уравнение 3; материалы и методы). С этими параметрами, используя уравнение Фёрстера, E = R06 / (R06 + r6), теоретическая эффективность FRET, E , Twitch-2B была определена как 0,98. Эффективность FRET, экспериментально определенная с помощью деканшинга донора, равна 0.78 (рис. S3A), что значительно ниже, чем полученное из кристаллической структуры.

Два мономера Twitch-2B в асимметричном блоке (рис. S1A) не только имеют очень похожую конформацию (RMSD основной цепи 0,992 Å), но также образуют очень похожие контакты упаковки кристаллов (рис. S1C). Таким образом, мы заключаем, что ориентация доменов в мономере сама по себе не ограничивается кристаллической упаковкой, а в основном внутримономерными взаимодействиями, описанными выше (рис. 2А), и, скорее всего, выбрана из пула уже существующих конформаций в растворе.Поскольку междоменные интерфейсы в мономере Twitch-2B относительно малы (рис. 2A), высокая гибкость решения может быть причиной наблюдаемого снижения эффективности FRET. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы затем обратили внимание на передовые методы ЯМР.

ЯМР-исследование динамики биосенсора

Чтобы получить представление о возможной динамике, мы использовали парамагнитный ЯМР ( 16 ) с образцом Twitch-2B, где два сайта связывания кальция TnC были загружены диспрозием (Dy).Анизотропная магнитная восприимчивость комплекса TnC-Dy 2 индуцирует парамагнитный тензор выравнивания, который может быть определен из структуры ( 17 ) (см. Материалы и методы). Мы использовали спектрометры на 900 МГц и 1,1 ГГц, поскольку тензор юстировки квадратично зависит от магнитного поля. Если данный флуоресцентный белок является жестким по отношению к TnC, то тензор выравнивания, который он испытывает, идентичен TnC. Если, однако, флуоресцентный белок является динамическим по отношению к TnC, то это движение уменьшит тензор выравнивания первого ( 16 , 18 ).Это позволяет количественно оценить динамику флуоресцентных белков по отношению к TnC. В то время как диполярные связи усредняются в изотропном растворе из-за случайного изотропного переворачивания, парамагнитно-индуцированные тензоры выравнивания приводят к анизотропному распределению ориентации TnC и, следовательно, прикрепленных зеленых флуоресцентных белков в растворе, что приводит к неполному усреднению диполярного муфты, позволяющие наблюдать остаточные диполярные связи (RDC). Мы определили RDC метильных групп парамагнитно выровненного Twitch-2B ( 19 ) (см. Материалы и методы).Наблюдаемый диапазон RDC достаточен для измерения размера тензора выравнивания ( 20 ), так что отнесение метильных групп не было необходимым.

Мы обнаружили, что диапазон значений RDC и, таким образом, тензор выравнивания, испытываемый флуоресцентными белками, в 10 раз меньше, чем рассчитанные по жесткой рентгеновской структуре (рис. 3; см. Материалы и методы). Таким образом, динамика должна быть причиной несоответствия между расчетной и экспериментальной эффективностями FRET.Кристаллическая структура может быть только частью динамического конформационного ансамбля в растворе.

Рис. 3 Гистограммы парамагнитных данных RDC.

Прогнозирование RDC метильных групп в двух доменах флуоресцентного белка и TnC с использованием рентгеновской структуры (выделено пурпурным цветом). Тензор выравнивания, индуцированный двумя ионами диспрозия, связанными с TnC, является результатом трансляции тензора, полученного из кальмодулина (см. Материалы и методы). Экспериментальные RDC от парамагнитного ЯМР Twitch-2B (зеленый) и Twitch-6 (пурпурный).Дальность действия уменьшается в 10 и 5 раз для Twitch-2B и Twitch-6 соответственно.

Конструирование мутанта на основе структуры с улучшенной эффективностью FRET

Предполагая структурную целостность отдельных доменов, мы предположили, что линкерные области являются стержнем этой динамики. На границах раздела между доменом TnC и донорным и акцепторным доменами преобладают полярные взаимодействия (рис. 2А). Мы предположили, что замена этих взаимодействий гидрофобными контактами сделает линкеры жесткими и увеличит экспериментальную эффективность FRET.С этой целью мы разработали мутацию N532F (рис. 2, D и E) на поверхности cpVenus cd , создавая новое взаимодействие с F249 кальций-связывающего домена (рис. 2D). Как и ожидалось, эта мутация вызвала существенное увеличение максимального изменения отношения FRET с 800 до 1100% in vitro (рис. S4). В кристаллической структуре этого мутанта (Twitch-6; таблица S2) боковая цепь F532 действительно связывается в гидрофобный карман, образованный боковыми цепями F249, Asp262 и Y338 (рис. 2E).В остальном структуры Twitch-6 и Twitch-2B очень похожи (RMSD 0,25 Å), что приводит к почти идентичной теоретической эффективности FRET (см. Дополнительные материалы). Благодаря этой конструкции экспериментальная эффективность FRET Twitch-6 увеличилась до 0,90, с 0,78 для Twitch-2B (рис. S3B), а диапазон RDC, измеренных с Twitch-6, удвоился по сравнению с Twitch-2B (рис. 3). . Это указывает на сужение интерфейса между доменом TnC и cpVenus cd , и, таким образом, снижение динамики между доменами является причиной увеличения FRET.

Конформационные ансамбли в решении

Определив динамику как причину снижения эффективности FRET Twitch-2B в решении, мы хотели получить представление о конформационном пространстве, возникающем в результате этой динамики. Для этой цели мы выбрали конформационные ансамбли, исследующие динамику скелета исключительно на динамических линкерных областях между доменами флуоресцентного белка и доменом TnC (см. Материалы и методы), оценивая более 1 миллиона шестичленных ансамблей в сравнении с наблюдаемыми RDC и эффективностью FRET (Таблица 1, рис.4 и Материалы и методы). Среди всех возможных ансамблей мы выбрали тот, который лучше всего воспроизводит как экспериментальную эффективность FRET, так и диапазон RDC (Таблица 1). Этот ансамбль полностью объясняет, как гибкость неупорядоченных остатков линкерных областей приводит к наблюдаемому снижению эффективности FRET и диапазона RDC.

Таблица 1 Результаты выбора ансамбля. Рис. 4 Ансамбли белков Twitch, согласующиеся с измеренными эффективностями RDC и FRET.

Ансамбли для Twitch-2B (слева) и Twitch-6 (справа) содержат по шесть структур каждый, причем самые большие отклоняющиеся структуры показаны зеленым и красным.Состояния, которые не являются этими крайними конформациями, прозрачны.

Влияние на улучшенную конструкцию датчика FRET

Таким образом, мы получили кристаллическую структуру флуоресцентного кальциевого биосенсора Twitch-2B и вместе с динамикой линкеров, определенной с помощью парамагнитного ЯМР, мы количественно оценили эффективность FRET. Поскольку динамика ограничивала эффективность FRET, мы успешно сконструировали ригидифицированный мутант с увеличенным FRET. Таким образом, структурные и динамические характеристики ратиометрических датчиков FRET обеспечили принципы проектирования, которые могут быть применимы к другим системам, в которых эффекты FRET используются для восприятия сигналов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование, экспрессия и очистка Twitch-2B и Twitch-6

Конструкция Twitch-2B была описана ранее ( 8 ). Для настоящего исследования кодирующую последовательность трехдоменного слитого белка клонировали в модифицированный вектор pET16b, кодирующий слитый белок с N-концевой меткой His 7 и расщепляющей последовательностью, распознающей вирус травления табака (TEV). Мутант Twitch-2B N532F (Twitch-6) был создан с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent).Экспрессионные конструкции pET16bTEV-Twitch-2B и pET16bTEV-Twitch-6 трансформировали в штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Экспрессию белка проводили при 303 К индукцией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали через 7 часов после индукции. Меченный селенометионином белок Twitch-2B был сверхэкспрессирован в метионин-ауксотрофном штамме B834 E. coli в минимальной среде с добавлением (+) — l-селенометионина в соответствии с группой по экспрессии белка EMBL (Европейская лаборатория молекулярной биологии) (www.embl.de).

Осадок клеток из 1 литра встряхиваемой культуры ресуспендировали в 60 мл лизирующего буфера [20 мМ трис-HCl (pH 7,9), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид, с одной таблеткой полного количества ЭДТА- свободных ингибиторов (Roche) на 100 мл лизисного буфера]. Клетки лизировали ультразвуком с последующим центрифугированием при 27000 g и 277 К. Из супернатанта рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом на 3 мл агарозной смолы Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA) (Qiagen).Слитую метку His 7 отщепляли протеазой TEV и удаляли инкубацией с 1 мл Ni-NTA агарозной смолы. Белок диализовали против 20 мМ трис (pH 7,0) и 150 мМ NaCl. После доведения концентрации сульфата аммония в растворе белка до 1 М белок дополнительно очищали хроматографией на гидрофобном взаимодействии на колонке с фенилсефарозой объемом 10 мл (GE Healthcare). Белок элюировали с этой колонки 50-мл градиентом от 1 до 0 М сульфата аммония.Фракции, содержащие белок, объединяли и концентрировали до объема 2,5 мл с помощью концентратора для ультрафильтрации с MWCO (пороговая молекулярная масса) 30 кДа (Vivascience). Наконец, белок очищали эксклюзионной хроматографией на гель-фильтрационной колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 мкг. Фракции пика объединяли, диализовали против 20 мМ трис-HCl (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl 2 , и концентрацию белка доводили до 20 мг / мл.

Флуоресцентная спектроскопия

Для спектроскопии рекомбинантного Twitch-2B in vitro белок был очищен от E.coli с использованием смолы Ni-NTA, как описано ( 6 ). Спектроскопию выполняли на спектрофотометре Cary Eclipse (Varian). Донорское расщепление Twitch-2B проводили путем переваривания Twitch-2B в связанном с кальцием состоянии в течение ночи при комнатной температуре с химотрипсином (70 Ед / мл; Sigma-Aldrich) при записи FRET. Небольшое оставшееся излучение cpVenus cd после переваривания химотрипсина было избирательно фотообесцвечено (5 мин) с помощью матрицы из шести светодиодов Luxeon Lumiled с пиком на длине волны 530 нм, с общей рассеиваемой мощностью 14.7 Вт и 870 люмен. Для защиты mCerulean3 от обесцвечивания использовали LP (длиннопроходный) фильтр с длиной волны 500 нм. Связанный с кальцием Twitch-6 был очень устойчив к расщеплению протеазой. Следовательно, EGTA (конечная концентрация, 5 мМ) добавляли во время переваривания химотрипсина, чтобы получить спектр деквенированного mCerulean3.

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Кристаллы Twitch-2B и Twitch-6 были получены путем диффузионного смешивания паров 1 мкл раствора белка с 1 мкл раствора для лунок [0.2 M Na-формиат (pH 7,0), 5 мМ CaCl 2 и 18-20% полиэтиленгликоля 3350]. Кристаллы были подвергнуты криозащите, перенеся их в хорошо раствор с добавлением от 16 до 18% глицерина на 1 мин и быстро охладив, погрузив их в жидкий азот.

Сбор данных производился в PXII, SLS, Швейцария, с использованием детектора PILATUS 6M (Dectris). Собственные данные собирали при 100 К на длине волны 1 Å. Данные по производному селенометионина были измерены при 0,98 Å. Все данные были обработаны с помощью программного обеспечения рентгеновского детектора (XDS) ( 21 ) и масштабированы с помощью SADABS (Bruker AXS).Определение пространственной группы и статистический анализ выполняли с использованием XPREP (Bruker AXS). Фазирование выполнялось с помощью AutoSol ( 22 ).

Первоначальная модель была построена с помощью AutoBuild и дважды уточнена с помощью phenix.refine ( 23 ) с промежуточным ручным построением модели с помощью Coot ( 24 ). Окончательная модель была получена путем комбинированного ручного отслеживания (Coot) и уточнения с использованием Refmac5 ( 25 ). На графике Рамачандрана 96,69% ​​остатков располагались в предпочтительной области 2.72% в разрешенной области и 0,58% остатков были выбросами. Кристаллическая структура Twitch-6 была решена с помощью PHASER ( 26 ), используя PDB (Protein Data Bank) запись 6GEL в качестве модели поиска. Построение и уточнение модели выполнялись, как описано для Twitch-2B. Для этого мутанта 96,68% остатков попали в предпочтительную область графика Рамачандрана, 2,83% попали в разрешенную область и 0,49% были выбросами.

Расчет FRET

Фактор ориентации κ 2 может быть извлечен из структурной информации следующим образом: κ2 = (cos θT — 3 cos θD cos θA) 2 (1) где θ T — угол между переходами излучения диполь донора и диполь перехода поглощения акцептора; θ D и θ A — углы между этими диполями и вектором r , соединяющим донорный и акцепторный флуорофоры ( 27 ).Ориентация дипольных моментов перехода относительно вектора связи C → O (ω) в градусах ωD = 73 ° ωA = 76 ° была взята из Ansbacher et al. ( 15 ), а угловые параметры были извлечены из кристаллографических координат в угловых единицах θT = 152,95 ° θD = 149,17 ° θA = 26,79 °

Подробные вычисления объяснены в файле данных S1. Интеграл перекрытия J (λ) был рассчитан из экспериментальных спектров поглощения и излучения изолированных доменов cpVenus и mCerulean3 соответственно (рис.S5) со сценарием Python, включенным в качестве дополнительной информации. J (λ) было определено как 2,052 × 10 15 M −1 см −1 нм 4 , как следует: J (λ) = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ∫0∞FD (λ) dλ (2) где F D (λ) — нормированная интенсивность флуоресценции донора в диапазоне длин волн от λ до λ + Δλ. ε A (λ) — коэффициент экстинкции акцептора при λ.

Расстояние Ферстера, R 0 , можно рассчитать на основе ранее полученных экспериментальных параметров R0 = 0.211 (κ2n − 4QDJ (λ)) 1/6 (3) где Q D (0,87) — квантовый выход донора в отсутствие акцептора ( 4 ) и n , (1,33) показатель преломления водной среды.

Наконец, эффективность передачи энергии, E , может быть рассчитана как отношение скорости передачи к общей скорости распада донора в присутствии акцептора E = R06R06 + r6 (4)

После этой процедуры, эффективность FRET была определена как E = 0. 979, из кристаллографической структуры Twitch-2B. Эквивалентный расчет, выполненный со структурой мутанта Twitch-6, дает E = 0,983 (см. Файлы данных S1 и S2).

ЯМР-спектроскопия

Мы экспрессировали белки Twitch-2B и Twitch-6 в минимальной среде Toronto, приготовленной из 100% D 2 O и пердейтерированной d-глюкозы и дополненной предшественниками аминокислот α-кетомасляной кислотой (метил-13C , 3,3-D2) и α-кетоизовалериановой кислоты (3-метил-13C, 3,4,4,4-D4), таким образом, селективно мечение атомами 13 C и 1 H только метильных групп остатки валина, лейцина и изолейцина, сохраняя при этом остальные атомы C как 12 C и протоны как 2 H ( 19 ).

Сначала были получены спектры изотропных образцов в буфере А [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl 2 в 100% D 2 O]. Затем белки диализовали против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ EDTA] с последующим диализом против буфера C [20 мМ Mops (pH 7,0) и 100 мМ NaCl] и, наконец, заменяли на буфер С, приготовленный в 100% D 2 O, содержащем три эквивалента диспрозия, перед измерениями ЯМР. Концентрация белка в образцах была примерно 0.5 мМ.

Образцы были протестированы с помощью экспериментов с метил-TROSY ( 19 , 28 ) (рис. S7) на частотах 900 МГц и 1,1 ГГц, а связи J, и J + RDC были определены с использованием J -модулированного Эксперимент с метил-TROSY ( 29 ), изображенный на рис. S6 в виде матриц 2048 × 128 комплексных точек данных с 96 переходными процессами на ( t 1 ) приращение. Общие использованные задержки модуляции J были следующими: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 мс (рис.S8). ЯМР-эксперименты проводились с использованием 5-мм TCI (криозонда тройного резонанса с инверсным детектированием) на спектрометре 900 МГц и 3-мм криозонда TCI на спектрометре 1,1 ГГц, оба оснащены консолями NEO (Bruker). Интенсивности (максимальная амплитуда) сигналов были извлечены с помощью CARA (компьютерное определение резонанса) ( 30 ) в экспериментах с обработкой NMRPipe ( 31 ) и проанализированы с помощью скриптов Python (рис. S8), следуя Pederson et al. ( 29 ).

Расчет парамагнитного тензора

Мы взяли парамагнитный тензор из комплекса кальмодулин-IQ, связанного с диспрозием, из ( 18 ) и рассчитали полный тензор дважды занятого кальцийсвязывающего домена TnC. Сайт связывания кальция 1 TnC перекрывается с сайтом связывания лантанидов кальмодулина (CaM N60D). Мы повернули матрицу выравнивания с сайта связывания кальция из CaM на второй сайт связывания кальция TnC и добавили его к тензору сайта связывания кальция 1, таким образом получив общий тензор TnC.Затем этот тензор использовался для расчета RDC из парамагнитных белков Twitch ACaM = (1,05 10−31−1,92 10−322,04 10−31−1,92 10−32−1,22 10−316,46 10−322,04 10−316,46 10−321,67 10−32 ) ATwitch = (1,46 10-318,39 10-323,46 10-318,39 10-32-1,06 10-312,26 10-323,46 10-312,26 10-32-3,92 10-32)

Тензоры даны в м 3 M −1 .

Генерация ансамбля

Сначала мы индивидуально смоделировали все возможные двугранные углы основной цепи (ϕ и ψ; выборка с шагом 60 °) линкерных остатков (от Arg 229 до Gln 231 для mCerulean3 и Met 311 для Gly 313 для cpVenus), что не привело к стерическому конфликту между одним из модифицированных доменов флуоресцентного белка и доменом TnC.Каждую из двух линкерных областей моделировали независимо. Из всех возможных комбинаций ϕ, ψ (117 649) вращение mCerulean3 привело к 477 возможным конформациям, в то время как cpVenus допустил 84 конформации, обеспечивая в целом 40 086 возможных конформаций.

Во-вторых, мы случайным образом объединили возможные структуры для mCerulean-TnC и TnC-cpVenus в ансамбли из шести членов. Мы произвольно отобрали 1 миллион шестичленных ансамблей из 40 068 возможных ϕ, ψ комбинаций линкеров между mCerulean и TnC и между TnC и cpVenus, чтобы гарантировать правильное исследование конформационного пространства Twitch.

В-третьих, мы рассчитали диапазон RDC (используя тензор, полученный, как описано выше) и FRET ансамблей и сравнили их с экспериментальными значениями, определив коэффициент качества ансамбля Qens = ∑i = 1i = 6 (RDCi − RDCeRDCe) 2+ (FRETi-FRETeFRETe) 2, где RDC i — диапазоны распределения, субиндекс e указывает экспериментальное значение, а i указывает значение из члена ансамбля. Такое значение добротности отличается от 0, если совпадения предсказанных откликов RDC и FRET от ансамбля отклоняются от экспериментальных данных, и 0 в случае полного совпадения.Наконец, ансамбли были отсортированы по их Q Ens , и был выбран самый низкий из них.

Измерения SAXS

Данные SAXS были собраны на канале BM29 Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция, с использованием автоматического устройства смены образцов ( 32 ). Белок подвергали диализу либо против буфера A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl 2 ] (связанное с кальцием состояние), либо против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА] (без кальция).Перед измерением белок центрифугировали для удаления более крупных частиц. Образцы измеряли при концентрациях 2,5, 10 и 20 мг / мл. Буфер для диализа использовали для коррекции эталонного буфера. Данные собирали при 293 К с использованием длины волны 0,995 Å и расстояния от образца до детектора 2,867 м. Загружали сто микролитров каждой концентрации образца, собирали и объединяли 10 кадров. Образцы непрерывно подавались в кювету, чтобы свести к минимуму эффекты радиационного повреждения.Изображения детектора были объединены и преобразованы в одномерные кривые рассеяния, а вклады буфера в рассеяние были вычтены с использованием программного обеспечения BsxCuBE. Дальнейшая обработка данных выполнялась автоматически с использованием онлайн-конвейера EDNA ( 33 ) для оценки качества образца и эффектов радиационного повреждения. Агрегации белков или радиационного повреждения не наблюдалось.

Данные были дополнительно проанализированы с помощью программного пакета ATSAS ( 34 ). Вкратце, первичная обработка и анализ данных проводились с использованием программ PRIMUS ( 35 ) и GNOM ( 36 ).

Теоретическое рассеяние от кристаллической структуры было рассчитано с использованием программы CRYSOL ( 37 ) (рис. S2), а молекулярные массы рассчитаны с использованием образца бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Благодарности: Мы благодарим персонал компании SLS, X10SA за поддержку при сборе рентгеновских данных и ESRF, BM29 за поддержку при сборе данных SAXS. Мы благодарим M. Paulat, C. Schwiegk и A. Moritz за техническую помощь в производстве белка и K.Оверкамп для масс-спектров электроспрея. С. благодарит T. Gruene и G. Sheldrick за советы по уточнению кристаллической структуры и структурному анализу. К.Г. и П.Т.-М. поблагодарить R. Kuemmerle (Bruker Biospin) за измерения ЯМР на частоте 1,1 ГГц. Источник: Эта работа была поддержана Обществом Макса Планка и DFG SFB 870 (O.G.). П.Т.-М. был поддержан докторской стипендией Гумбольдта. Вклад авторов: P.T.-M. выполнен ЯМР. П.Т.-М. и К.Г. разработал парамагнитный метод ЯМР.П.Т.-М. рассчитаны структурные ансамбли. П.Т.-М. и С. выполнены измерения SAXS. К.Г. рассчитал FRET по рентгеновским структурам. T.T. и O.G. определили экспериментальные эффективности FRET. С. кристаллизовал Twitch-2B и Twitch-6 и решил кристаллические структуры. Рукопись написана всеми авторами. С. разработал проект. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Структуры депонированы с кодом 6GEL для биосенсора Twitch-2B и 6GEZ для мутанта Twitch-2B N532F (Twitch-6).Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

Мембранные белки составляют 1 / 4–1 / 3 от общего числа 30000 белков, кодируемых геномом человека.Мембранные белки играют важную роль в различных сложных и уникальных клеточных процессах, включая транспортировку материалов, распознавание клеток, иммунный ответ, передачу и регуляцию сигналов, а также передачу энергии, et.al . Почти 70% известных или исследуемых мишеней для лекарств — это мембранные белки. По-прежнему остается сложной задачей определение структур и выполнение функциональных анализов мембранных белков.

Creative Biostructure создал отличную сервисную платформу для преобразования генов мембранных белков в структуру, созданную группой опытных профессионалов.Наши услуги по предоставлению полного набора мембранных белков, включая экспрессию и очистку, кристаллизацию и определение, а также различные функциональные анализы как in vivo, и in vitro, , продвигают ваши научные исследования в ускоряющемся и динамичном темпе. Creative Biostructure может спроектировать и предоставить индивидуальный анализ Mempro ™ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) или анализ FRET для функционального исследования взаимодействий мембранных белков.

Белковые взаимодействия имеют решающее значение для сигнальных сетей мембранных белков.Однако резонансный перенос энергии флуоресценции может иметь место только в том случае, если расстояние донор-акцептор не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий с мембранными белками.

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии ( FRET ), один из наших наиболее передовых и желаемых методов с широким диапазоном применения, выполняет анализы для прямого определения состояния олигомеризации и степени олигомеризации мембранных белков в их естественной среде.FRET — это зависящее от расстояния взаимодействие между флуоресцентными донорно-акцепторными парами в непосредственной близости, при котором энергия флуоресценции передается от возбужденного донора к подходящей молекуле акцептора без излучения. Эффективность FRET сильно зависит от расстояния донор-акцептор и от спектров перекрытия донорного излучения и возбуждения акцептора.

Рисунок 1. Схематический график фотофизического процесса FRET (Molecules, 2012)

FRET может иметь место только в том случае, если расстояние донор-акцептор не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий с мембранными белками.Creative Biostructure может предоставить платформу Mempro ™ FRET для выполнения специального структурного и функционального анализа мембранных белков.

• Mempro ™ FRET с индивидуальной парой донор-акцептор

Принимая во внимание большое влияние расстояния Форстера на FRET, Creative Biostructure может помочь вам выбрать оптимальную флуоресцентную пару донор-акцептор в соответствии с вашими особенностями требование исследования мембранного белка.

Таблица 1.Популярные донорно-акцепторные пары FRET и их фотофизические свойства.

Оптимальные условия для FRET:
1. Донорно-акцепторная пара должна находиться на близком расстоянии (обычно 1–10 нм).
2. Перекрытие спектра поглощения акцептора и спектра излучения донора.
3. Ориентация донора и акцептора должна быть примерно параллельна.

• Mempro ™ FRET для индивидуальных целей

FRET может обеспечить не только качественные измерения, но и количественные данные в исследованиях функции мембраны. Creative Biostructure разработала полный набор методов FRET , таких как 1) Upconversion FRET , 2) Photochromic FRET , 3) Single-Molecule-FRET , и 4) FRET Frustration et. al . Creative Biostructure — ваш компетентный и профессиональный партнер в области научных исследований для выполнения всех видов FRET-приложений мембранных белков, включая ：
1. Структура и конформация мембранных белков,
2.Пространственное распределение мембранных белков,
3. Олигомеризация мембранных белковых комплексов,
4. Мембранный белок участвует во взаимодействиях рецептор / лиганд,
5. Взаимодействие между мембранными липидами и мембранными белками.

Рисунок 2. Внутримолекулярный и межмолекулярный FRET (Current Opinion in Structural Biology, 2001)

Рисунок 3. Применение сигломолекулярного FRET (J. Am. Chem. Soc., 2013)

Рисунок 4. Измерение взаимодействия между мембранами белков, липидов и лигандов по FRET (PNAS, 2013)

• Mempro ™ FRET с индивидуальными подходами к визуализации

Компания Creative Biostructure разработала ряд методов для определения FRET.Обычно мы предлагаем три индивидуальных подхода, которые оказались особенно полезными, исходя из практических соображений:
1. Фотообесцвечивание донора и акцептора
FRET можно создать путем доступа к скорости обесцвечивания донора с присутствием акцептора и без него. Основными двумя преимуществами этого подхода являются: относительно простота и легкость выполнения. Требуются соответствующие комплекты фильтров и мощный источник света, позволяющий отбеливать акцептор.
2. Сенсибилизированная эмиссия
Сенсибилизированная эмиссия — это самый простой метод обнаружения FRET, и наиболее идеальным условием для этого метода является полное разделение каналов донора и акцептора и отсутствие перекрестных помех между ними.
3. Флуоресцентная микроскопия для визуализации времени жизни
Флуоресцентная микроскопия для визуализации времени жизни, также называемая FLIM, может использоваться для картирования пространственного распределения времен жизни флуорохромов как в микроскопических изображениях, так и в живых клетках. Creative Biostructure может определять точное пространственное расположение или распределение мембранных белков с высоким разрешением и специфичностью в живых клетках.

Creative Biostructure также предоставляет ряд услуг по функциональному анализу Mempro ™. Пожалуйста, свяжитесь с нами для получения подробного предложения.

Ссылки:
H. C. Ishikawa-Ankerhold, et al . (2012). Передовые методы флуоресцентной микроскопии — FRAP, FLIP, FLAP, FRET и FLIM. Молекулы , 1 ​​ 7 (3): 4047-4132.
К. Чыонг и М. Икура. (2001). Использование микроскопии изображений FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий и изменений конформации белков in vivo. Текущее мнение в структурной биологии , 11 : 573-578.
W. Bae, и др. . (2013). Наблюдение в реальном времени за образованием множественных белков с помощью одномолекулярного FRET. J. Am. Chem. Soc ., 135 (28): 10254-10257.
C. Matsushita, и др. . (2013). Ориентация трансмембранной спирали влияет на связывание с мембраной внутриклеточного юкстамембранного домена в пептидах рецептора Neu. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 110 (5): 1646–1651.