«АвтоВАЗ» возобновил сборку Lada Largus и Lada Xray
2021-06-10T08:20:00+03:00
2021-06-10T08:21:50+03:00
2021-06-10T08:20:00+03:00
2021
https://1prime.ru/auto/20210610/833894829.html
«АвтоВАЗ» возобновил сборку Lada Largus и Lada Xray
Авто
Новости
ru-RU
https://1prime.ru/docs/terms/terms_of_use.html
https://россиясегодня.рф
«АвтоВАЗ» возобновил производство автомобилей на сборочной линии B0 после трехдневного простоя из-за нехватки электронных компонентов, сообщил РИА Новости официальный… ПРАЙМ, 10.06.2021
lada largus, автомобили, автоваз, lada, промышленность, новости, бизнес, авто
https://1prime.ru/images/83389/48/833894858.jpg
1920
1440
true
https://1prime.ru/images/83389/48/833894858.jpg
https://1prime.ru/images/83389/48/833894857.jpg
1920
1080
true
https://1prime.ru/images/83389/48/833894857.jpg
https://1prime.ru/images/83389/48/833894856.
jpg
1920
1920
true
https://1prime.ru/images/83389/48/833894856.jpg
https://1prime.ru/business/20210515/833667826.html
Агентство экономической информации ПРАЙМ
7 495 645-37-00
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://россиясегодня.рф/awards/
Агентство экономической информации ПРАЙМ
7 495 645-37-00
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://россиясегодня.рф/awards/
Агентство экономической информации ПРАЙМ
7 495 645-37-00
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://россиясегодня.рф/awards/
Агентство экономической информации ПРАЙМ
7 495 645-37-00
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://россиясегодня.рф/awards/
Агентство экономической информации ПРАЙМ
7 495 645-37-00
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://россиясегодня.рф/awards/
МОСКВА, 10 июня — ПРАЙМ. «АвтоВАЗ» возобновил производство автомобилей на сборочной линии B0 после трехдневного простоя из-за нехватки электронных компонентов, сообщил РИА Новости официальный представитель компании.
Lada и Kia остаются самыми популярными марками в автолизинге в России
«Сегодня, как и планировали, запустили линию B0 после приостановки с 7 по 9 июня», — отметил он.
На платформе B0 компания в том числе производит Lada Largus и Lada Xray.
Из-за дефицита комплектующих «АвтоВАЗ» ранее также приостановил сборку Lada Granta и Lada Niva Legend. Работу этих линий компания планирует возобновить 11 июня.
«АвтоВАЗ» производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для двух брендов — Lada и Renault. Производственные мощности «АвтоВАЗа» расположены в Тольятти – АО «АвтоВАЗ», ОАО «Lada Запад Тольятти», а также в Ижевске – ООО «Lada Ижевск». Продукция марки Lada состоит из пяти семейств моделей: Vesta, Xray, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20%.
Интересные факты о линии сборки Лада Ларгус и Лада Икс Рей
Вазовский канал «LADA ТВ» выпустил сюжет о производственной линии В0. Именно на этой линии выпускаются машины, в основе которых лежит принадлежащая Альянсу одноименная платформа В0: LADA Largus и LADA XRAY, а также Renault Logan и Sandero.
Официальное название линии звучит как «Производство автомобилей на платформе B0». В сокращенной версии оно именуется ПАП В0. Данное производство стало первым совместным проектом, реализованным АвтоваЗом и Альянсом Рено-Ниссан. В одном потоке с линии сходят несколько моделей машин. Речь идет о семействах Лада Ларгус и Лада Икс Рей. Также на этой линии выпускают две модели марки Рено. Это Рено Логан и Рено Сандеро. На производстве задействовано 3 тысячи 600 сотрудников. При работе в три смены линия может выпускать 280 тысяч авто каждый год.
На участке сварки ПАП В0 задействовано 40 сварочных роботов. Помимо этого здесь используются сварочные манипуляторы, оборудованные автоматической системой по контролю качества выполнения сварки деталей будущего авто.
Основой участки окраски является современное оборудование, которое отвечает требованиям актуальных технических и экологических норм. Комплекс окрасочного оборудования включает не только механизмы для непосредственной окраски, но еще и системы для очистки воздуха и воды.
Линия сборки ПАП В0 включает девять участков. Все они отвечают требованиям стандартов производства концерна Рено. Каждый час с линии может сходить максимум 60 машин. На сборочной линии также используется интересное оборудование. Например, на стекла машины клей наносят специальные роботы. Рабочие жидкости (охлаждающая и тормозная) в машину заливают с предварительным вакуумированием. Завершающей стадией производства является контроль качества готовых авто. Вместе с тем на линии сборки качество авто проверяется практически на каждом этапе производства.
Dacia и Lada объединятся, новая «Нива» получит платформу Renault
Сегодня, 14 января, гендиректор группы Renault Лука де Мео представил новый стратегический план, который получил название Renaulution («Ренолюция»).
Программа уже утверждена советом директоров, ее начали выполнять. Ключевая идея – отказ от наращивания объемов производства в пользу увеличения прибыльности. И да, России и нашей «Лады» все это напрямую касается.
Стратегия де Мео разделена на три стадии, их реализация будет осуществляться параллельно.
«Возрождение». До 2023 года группа сосредоточится на восстановлении прибыльности и наращивании денежных средств.
«Обновление». К 2025 году предполагается обновить и расширить товарные линейки брендов с упором на успешные продукты.
«Революция». С 2025 года производитель начнет менять бизнес-модель, ориентируясь на технологии, энергетику и сервисы мобильности. Цель – сделать группу Renault лидером в сфере так называемой «новой мобильности».
Стратегия Renaulution нацелена на восстановление конкурентоспособности. Среди прочего, она включает в себя и «План 2022», озвученный в мае прошлого года и подразумевающий сокращение фиксированных расходов более чем на два миллиарда евро в течение трех лет за счет экономии на инженерно-техническом обеспечении и маркетинге, а также оптимизации производства.
Кроме того, группа будет опираться на свои промышленные активы и лидерство в сегменте электромобилей в Европе. Используя возможности альянса Renault-Nissan-Mitsubishi, она не только расширит продуктовую линейку, но и освоит новые сегменты бизнеса, включая услуги, связанные с энергопотреблением и работой с данными.
Наконец, повышению прибыльности должна способствовать новая простая и прозрачная структура из четырех бизнес-единиц, четко ориентированных на конкретных клиентов и страны. Эффективность этой организации будет оцениваться не по объемам производства и долям на рынке, а исключительно по рентабельности, способности генерировать денежные потоки и эффективности инвестиций.
По замыслу Луки де Мео, Renault должна превратиться из автомобильной компании, занимающейся технологиями, в технологическую компанию, занимающуюся автомобилями. К 2030 году не менее 20% доходов группе будут приносить не машины, а продажа услуг, данных и энергии.
Для повышения инженерной и производственной эффективности группа сократит число используемых платформ с шести до трех, а семейств силовых агрегатов – с восьми до четырех.
Вышеупомянутые четыре бизнес-единицы – это собственно Renault, Dacia-Lada, Alpine и новое подразделение Mobilize. В совокупности они выпустят к 2025 году 24 новых модели. Половина из них будет относиться к сегментам C и D, не менее 10 будут полностью электрическими.
Титульный бренд Renault займется инновациями, в том числе – за пределами автопрома. В частности, появится совместное предприятие, специализирующееся на водородных технологиях – от топливных ячеек до машин и инфраструктуры. Также компания надеется стать лидером в сфере экономики замкнутого цикла, а еще – зарабатывать на big data и кибербезопасности, для чего французы создают так называемую Software Factory: продвинутую лабораторию на тысячу инженеров и ученых.
Что же касается новых автомобилей для Европы, половина из них будут полностью электрическими, а у остальных появятся гибридные версии. Среди прочего, в виде электрокара возродят Renault 5! Причем Лука де Мео пообещал, что батарейный хэтч окажется доступным – не дороже бензиновых аналогов. Другими ключевыми для себя рынками марка называет Латинскую Америку и Россию.
12 Фотографии
Новый альянс Dacia-Lada ориентирован на создание суперэффективной бизнес-модели. К 2025 году он запустит 7 новинок, включая две в C-сегменте. При этом число используемых «тележек» сократится с четырех до одной (CMF-B), а типов кузова – с 18 до 11. Вместе с тем, объемы производства вырастут с 0,3 до 1,1 миллиона единиц на платформу.
Слухи подтвердились. «Нива» переедет на платформу CMF-B. Причем официально заявлено – в семейство войдут две модели: поменьше и побольше, с удлиненной колесной базой.
Французскую архитектуру получит и «Нива» следующего поколения, дебют которой, как теперь заявлено, намечен на 2024 год. Из деталей пока только дизайнерский набросок (впрочем, довольно интересный).
А у «Дачии» появится новый кроссовер, который уже продемонстрировали в виде концепта Bigster, не раскрыв подробностей. Не хочется о грустном, но, похоже, все идет к тому, что шансы увидеть в будущем самостоятельные разработки АвтоВАЗа на оригинальных платформах стремятся к нулю. Тем не менее, до 2025 года Lada представит, помимо упомянутой «Нивы», четыре свежие модели, в том числе некий SUV C-сегмента.
Марка Alpine объединится с подразделениями Renault Sport Cars и Renault Sport Racing в новое «умное» предприятие, занимающееся инновационными спорткарами. Все они будут 100% электрическими. Помимо моделей на уже знакомых платформах CMF-B и CMF-EV, появятся машины, разработанные совместно с Lotus.
К 2025 году подразделение должно стать прибыльным, в том числе – за счет отдачи от инвестиций в автоспорт.
Наконец, новыми сервисами мобильности, торговлей энергией и данными займется Mobilize. Оно будет взаимодействовать как с другими брендами группы, так и с внешними партнерами. Ключевые миссии – увеличение «коэффициента использования» автомобиля, повышение остаточной стоимости и приближение к нулевому выбросу CO2.
17 ФотографииMobilize разработает четыре специализированных модели: два автомобиля для каршеринга, один для перевозки пассажиров, а также транспортное средство «последней мили».
С финансовой точки зрения «Ренолюция» должна позволить группе Renault выйти на операционную маржу свыше 3% к 2023 году и не менее 5% к 2025 году.
Какие они — LADA Vesta и LADA XRay? (ФОТО)
Корреспондент АА «АВТОСТАТ» 27 августа 2014 года побывал на презентации АВТОВАЗом концепт-каров.
В Тольятти в здании заводоуправления были показаны концепты LADA Vesta и LADA XRAY 2. Как это проходило и как выглядят концепты вблизи рассказывает Дмитрий Ярыгин.
LADA Vesta имеет схожие габариты с LADA Priora, разве что база у новинки более растянута. Lada Vesta будет построена на собственной платформе. Уже утверждена гамма моторов, это 2 вазовских мотора и один заимствованный агрегат у автомобилей альянса. Трансмиссии также будет три — 5-ти ступенчатая механика с тросовым приводом и роботизированная коробка передач, презентацию которой АвтоВАЗ провел на LADA Priora. Представители завода пообещали, что все лицевые панели будут из оцинкованной стали, следовательно, можно будет не опасаться, что через пару лет эксплуатации автомобиль потеряет лоск и «зацветет».
В продаже модель должна появиться в 2015 году, цены пока не определены.
18-ти дюймовые диски с оригинальным дизайном прерогатива концепт-кара. Маловероятно, что они доберутся до конвейера. LADA Vesta на них смотрится гармонично.
На новинке вместо ладьи на крышке багажника будет надпись LADA.
Дизайн автомобиля утвержден. По заверениям представителей АВТОВАЗа изменениям подвергнется только оптика, при этом архитектура будет сохранена.
Фары, скорее всего, будут попроще.
У продукции завода появилось лицо — узнаваемый X. Такой дизайн должен найти отражение в последующих новинках…
Стиль Х — и на боковых поверхностях…
Разработчики отвечают на вопросы журналистов по дизайну и технической части.
Второй новинкой, показанной на презентации, стал концепт XRay в кузове хэтчбек. Первый XRay был представлен два года назад на Московском автосалоне и был похож больше на кроссовер. Он дал понять, в каком направлении будет развиваться дизайн автомобилей LADA в дальнейшем.
Новинка построена на платформе Renault Sandero и первое время будет оснащаться моторами и коробками альянса.
Дизайн стал более сдержанным и реальным.
..
Хотя сзади модель кого-то напоминает…
Будем ждать модель XRay в продаже, с ее выразительным взглядом…
3 главных отличия от Dacia Bigster — журнал За рулем
Планируется, что у Нивы будет другая длина кузова, иная геометрическая проходимость и трансмиссия с более широкими возможностями на бездорожье.
Материалы по теме
В своем недавнем интервью французскому изданию Challenges президент АВТОВАЗа Николя Мор рассказал о перспективном семействе внедорожников Lada нового поколения. В частности, он заметил, что будет два варианта колесной базы, которые можно обозначить как Niva и Grand Niva. Кроме того, он напомнил, что машины будут построены на единой платформе Renault CMF-B — как и перспективный кроссовер Dacia Bigster.
Несмотря на очевидное родство моделей двух брендов (Dacia и Lada теперь входят в единую бизнес-структуру внутри Renault Group), у автомобилей будут довольно существенные различия, о которых упомянул Николя Мор.
Из речи президента можно выделить три основополагающих момента, свойственные третьему поколению внедорожников Lada Niva и отличающие его от кроссовера румынского бренда.
Внедорожники марки Lada будут короче, чем Bigster
По предварительным данным, Niva будет трехдверной, а Grand Niva (это название пока можно считать лишь условным) — пятидверной, так что с Бигстером имеет смысл сравнивать именно «старшую» версию. Заявленная длина Dacia Bigster — около 4,6 метра; салон 5-местный, но не исключается и появление 7-местных версий. Вероятно, Grand Niva будет в большей степени сориентирована на бездорожье и получит более короткие свесы.
Материалы по теме
Niva будет иметь дорожный просвет в 24 см
Нынешние Niva Legend и Niva Travel имеют клиренс около 205 мм, и это выдающийся результат для внедорожника любого размера. Судя по опубликованным изображениям Dacia Bigster (рендеры концепта и патентные изображения), у него просвет тоже окажется близким к 200 мм, однако едва ли показатель дотянется до 240 мм — такая цифра больше соответствует внедорожникам вроде Land Rover Defender, причем в специальной подготовке.
Будет «короткий» ряд передач в КП
Именно этот внедорожник приводит в пример Николя Мор, когда описывает внедорожные качества нового семейства Lada Niva: «Это будет настоящий 4х4 с короткой передачей, дорожным просветом 24 сантиметра и проходимостью, как у Land Rover Defender», — заявил он в интервью французскому изданию. Итак, третье отличие — это особая трансмиссия, которой у Бигстера не будет.
Ранее на АВТОВАЗе заявили, что планируют для новой Нивы полноценный полный привод с понижающим рядом передач.
Фото: Renault Group
Рустам Минниханов протестировал новые автомобили Lada Vesta и Lada XRay — Единый Портал органов государственной власти и местного самоуправления «Официальный Татарстан»
24.07.2015Сегодня в Казани перед Домом Правительства РТ состоялась презентация новых автомобилей Lada Vesta и Lada XRay, серийное производство которых планируется начать уже в этом году. С новинками отечественного автопрома ознакомился временно исполняющий обязанности Президента Республики Татарстан Рустам Минниханов.
Вместе с президентом ОАО «АвтоВАЗ» Бу Инге Андерссоном Рустам Минниханов провёл тест-драйв новых автомобилей, проехав до Казанского Кремля и обратно.
«Впечатления очень хорошие. Отличная машина, доступная, хорошо управляемая», — сказал Рустам Минниханов в интервью журналистам после завершения тест-драйва.
Он подчеркнул, что Lada Vesta полностью разработана в Тольятти. Сегодня АвтоВАЗ имеет полный модельный ряд в зависимости от финансовых возможностей и потребностей покупателей, сказал врио Президента РТ. Главными достоинствами новых автомобилей он назвал удобное переключение передач, ровную работу двигателя, хорошую тормозную систему и надёжную подвеску. «Я специально пробовал тормозить и часто переключался. Мне очень понравилось, достойный автомобиль», — заключил Рустам Минниханов.
Он также отметил, что компания «АвтоВАЗ» является национальным партнером Чемпионата мира по водным видам спорта, который стартует сегодня в Казани. Рустам Минниханов подчеркнул, что новые автомобили Lada по своей цене и адаптации к российским дорогам могут дать фору некоторым иностранным моделям.
«Я уверен, что многие наши зарубежные гости удивятся тому, что российские автомобили ничем не уступают зарубежным. Этому подтверждение тот модельный ряд, который сегодня разработан на автозаводе. Я могу сказать, что новые модели – это автомобили мирового уровня. Рекомендую, советую покупать наши российские отечественные автомобили», — добавил врио Президента РТ.
Бу Инге Андерссон, в свою очередь, отметил, что по дорогам Татарстана сегодня ездят порядка 500 тысяч автомобилей Lada.
Он заявил, что производство нового автомобиля Lada Vesta начнется 25 сентября этого года, а Lada XRay – 15 декабря. Рассказывая о ситуации на отечественном рынке в целом, он сообщил, что в первом полугодии 2015 года Волжский автозавод выпустил 288 тысяч автомобилей. «Анализируя наш потенциал на вторую половину этого года, мы можем сказать, что будет произведено еще порядка 200 тысяч машин. Никто не знает как будет развиваться ситуация на рынке, но мы знаем что у нас надежные автомобили хорошего качества», — подчеркнул он.
Пресс-служба Президента РТ, Булат Низамеев.
Завершилась 34-я Московская международная книжная ярмарка (ММКЯ-2021)
27 сентября 2021 года завершилась 34-я Московская международная книжная ярмарка, которая в этом году проходила в Центральном выставочном комплексе «Экспоцентр» на Красной Пресне. Главный книжный форум осени на 4 дня стал центром внимания книголюбов, писателей, художников-иллюстраторов и книгоиздателей: на 9 площадках ярмарки прошло более 300 мероприятий, включая деловую и читательскую программы, мероприятия для детей и их родителей.
34-я Московская международная книжная ярмарка
в Центральном выставочном комплексе «Экспоцентр»
Куратор «Детской сцены» Российская государственная детская библиотека совместно с детскими издательствами подготовила для гостей ММКЯ-2021 насыщенную программу, в рамках которой прошло более 30 мероприятий, посвященных осенним новинкам детской литературы.
Юные читатели смогли встретиться с любимыми авторами: на Детской сцене выступили Анна Гончарова, Игорь Жуков, Наталия Волкова, Елена Усачева, Григорий Кружков, Оксана Иванова, Юлия Лавряшина, Марина Аромштам, Лада Кутузова, Ирина Цхай, Юрий Нечипоренко, Елена Ива, Лариса Романовская, Ольга Дробот и многие другие.
Российская государственная детская библиотека презентовала свой новый проект – виртуальный музей «Диафильм. Онлайн», который уже в декабре 2021 года откроет для посетителей 6 этажей настоящего позитива! По словам заместителя директора РГДБ Ильи Гавришина, новое виртуальное пространство будет включать в себя более 4500 диафильмов студии «Диафильм», историю студии, интерактивную галерею диапроекторов, оригиналы работ художников. Уникальная коллекция будет собрана для детей, школьников, профессионалов, а также для семейного просмотра.
Илья Гавришин на презентации виртуального музея «Диафильм. Онлайн»
В рамках международной программы состоялось публичное онлайн-интервью с Сьюзи Эрзахин, директором крупнейшей международной награды в области детской литературы – Мемориальной премии им. Астрид Линдгрен. Она рассказала гостям ярмарки о том, как личность Астрид Линдгрен и ее взгляды повлияли на концепцию премии, как члены жюри работают с произведениями на иностранных языках, есть ли шансы у представителей малых народов быть номинированными. Важной частью беседы стало обсуждение проектов по продвижению премии и созданию вокруг нее сообщества единомышленников. Также прошла онлайн-встреча с бразильской писательницей Марианжелой Гуаденин. Она рассказала о том, как создаёт своих героев и почему пишет для современных детей.
Ольга Переходцева и Сьюзи Эрзахин
Финалисты и лауреаты литературной премии «Большая сказка» имени Эдуарда Успенского Григорий Кружков, Юлия Лавряшина, Оксана Иванова, Ирина Цхай, Марина Аромштам и Лада Кутузова собрались на главном книжном форуме осени, чтобы подвести предварительные итоги второго сезона премии, который подходит к концу: 11 октября 2021 года закончится прием работ и члены жюри приступят к их оценке.
Получившая третий приз Оксана Иванова подчеркнула, что писатель Эдуард Успенский, именем которого названа премия «Большая сказка», всегда был для нее примером:
«Мне в прямом смысле слова подарили крылья. И я очень рада, что премия носит имя Эдуарда Успенского, потому что его герои всегда со мной. Свойственные творчеству Эдуарда Николаевича свобода, радость жизни, парадоксальность, нелинейность, ощущение праздника и «по-успенски» веселой игры – все это навсегда с нами, и это тот источник вдохновения, благодаря которому я пишу»
Презентация премии «Большая сказка» имени Эдуарда Успенского на ММКЯ-2021
Главный библиотекарь Центральной городской детской библиотеки им. А.П. Гайдара Татьяна Рудишина рассказала о фестивале короткого рассказа «Кора», который возник потому, что именно короткиий рассказ зажигает интерес в читателях и вовлекает их в удивительный книжный мир.
Организаторы уверены, что такой формат является квинтэссенцией писательского мастерства и помогает раскрывать новые таланты. Работы участников «Коры», собравшей весь цвет современных авторов, активно пишущих для детей и подростков, появились в новом выпуске журнала «Кракатук».
Журналист, переводчик, шеф-редактор портала ГодЛитературы Михаил Визель представил новинки жанра «silent books» (молчаливые книги), выпущенные издательством «Ласка-пресс».
Издательство «Bubble» презентовало новую серию детских комиксов «Громада» для семейного чтения. Сценарист серии Кирилл Кутузов отметил, что комиксы как форма искусства очень хорошо подходят людям всех возрастов, но особенно детям, потому что позволяют им погружаться в произведение в своем собственном темпе и возвращаться к сложным или непонятным моментам.
Настоящим подарком для ценителей иллюстрации стало интервью с художницей Юлией Гуковой, номинантом на Золотую Медаль Ханса Кристиана Андерсена – 2022 от России.
Беседу с Юлией провела художник-иллюстратор Ольга Монина.
Юлия Гукова и Ольга Монина
Юлия Гукова проиллюстрировала более сорока книг в России и за рубежом. Много работает в области журнальной графики, а также в качестве художника кино, мультипликации и компьютерной анимации. Гостям ярмарки Юлия рассказала о том, как пришла в книжную иллюстрацию, кто стал для нее примером и первым учителем, как появились первые заказы и в чем секрет работы с авторским текстом:
«Когда есть текст, у меня в душе появляется химия и драйв. Можно текст подхватить, и как два дельфина вместе с ним поплыть, а можно с ним поспорить. Я могу «попрыгать» на тексте, могу его «причесать», и это ощущение свободы – настоящее счастье» – отметила Юлия Гукова.
Победители отборочных туров Чемпионата по чтению вслух «Урок чтения» прочли отрывки из прозаических и поэтических произведений российских и зарубежных детских писателей, чтобы выяснить, кто же из них странет победителем очередного этапа.
Идя навстречу пожеланиям педагогов, родителей и учащихся, оргкомитет Чемпионата по чтению вслух среди старшеклассников «Страница» расширил аудиторию и устроил соревнование среди школьников младшей возрастной категории.
Чемпионат по чтению вслух «Урок чтения»
В последний день ярмарки на отраслевой конференции «Книжный рынок России-2021» исполнительный директор Ассоциации «Растим читателя» Анжела Лебедева рассказала об итогах 37-го Всемирного конгресса Международного совета по детской книге (IBBY), который проходил в Москве с 10 по 12 сентября 2021 года.
Анжела Лебедева отметила, что в сфере детской литературы 37-й Всемирный конгресс Международного совета по детской книге стал первым событием такого масштаба в нашей стране:
«В рамках Конгресса выступили участники из 52 стран, прошло 5 пленарных заседаний, было представлено 200 докладов и постер-сессий в режимах офлайн и онлайн – этот гибридный формат был использован впервые за всю историю существования Международного совета по детской книге, который работает с 1953 года.
»
»
Подведение итогов 37-го Всемирного конгресса IBBY
на отраслевой конференции «Книжный рынок России-2021»
В дни проведения ярмарки гости детской секции могли посмотреть выставку «BIB 2019: лауреаты Биеннале иллюстрации в Братиславе». В экспозицию вошли работы художников Андре Летриа (Португалия), Яниса Бланкса (Латвия), Анат Варшавски (Израиль), Жу Ченляна (Китай), обладателя «Золотого яблока BIB» Антона Ломаева (Россия) и др., а также иллюстрации обладателя Гран-при BIB – иранского художника Хасана Мусави.
А еще 338 человек записались в РГДБ и получили читательский билет!
Фото: пресс-служба РГДБ
Больше фотографий в Фотогалерее РГДБ
Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo
Конструирование плазмиды
Комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая mTurquoise, и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart 43 .
кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены с помощью сайт-специфического мутагенеза с помощью ПЦР. Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) 43 и K206A (для Turquoise2-GL).Прототип биосенсора FRET активности ERK, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно 19 . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP. Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan).Точно так же CFP в PicchuEV-x 19,44,45 и RaichuEV-Ras 19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 для генерации hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно.
В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов.Варианты NanoLuc hyBRET-ERK также были получены реакцией In-Fusion. CeNL, гибридный белок Turquoise2 и NanoLuc, был описан ранее 22 . Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS 47 или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) 48 ..jpg)
Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки компонентов, кодирующих кДНК hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) и кодон-оптимизированным YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP 49 . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK был заменен на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК.Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена в вектор CSII-EF с IRES-puro, и кДНК для голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были амплифицированы с помощью ПЦР и субклонированы в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов. pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее 50 . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion.
Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548–1020) или интер-Sh3 доменом p85 человека (aa 428–621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 51 . Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена перед последовательностью поли А.Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.
Культура клеток и создание стабильных клеточных линий
Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония). Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония).
Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере 5% CO2 на воздухе при 37 ° C. Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase 48 , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute.Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали с помощью 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем дополнительно культивировали в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T котрансфицировали вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида # 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком доктора.
Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Уоррингтон, Пенсильвания).Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.
Реагенты
Диацетилцелентеразин-h был синтезирован, как описано ранее 14 . Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония).Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и эпидермальный фактор роста были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использован для липофекции плазмиды в клетки HeLa.
Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина. Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.
Спектроскопия
Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор высевали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock). YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus).Спектры флуоресценции регистрировали с интервалом 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES.
К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12. Полученные спектры флуоресценции и люминесценции были использованы для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.
Оценка эффективности передачи энергии
Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны под теоретические спектры излучения, по существу, как сообщалось ранее 20 . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон). Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:
$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$
(1)
где F ( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε c ( λ бывший ) — коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E CY — КПД FRET между CFP и YFP, ϕ C — квантовая эффективность CFP, f C ( λ ) — нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ Y — квантовая эффективность YFP, f Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε Y ( λ бывший ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения.
Модель ε Y ( λ бывший ) значение при 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε Y ( λ бывший ) значение при 513 нм.
Предполагая, что внутрикадровое слияние RLuc8 на C-конце не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:
$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} — {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$
(2)
где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E RC — это эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E RY — это эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ R — квантовая эффективность RLuc8, а f R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.
E CY был оценен путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к формуле. 1. E RC Предполагается, что является постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ CNL , выражается следующим уравнением:
$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$
(3)
Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E RC было определено как 0,13. Наконец, E RY был оценен путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.
2. Значения ε и ϕ перечислены в Таблице S1.
Скорости передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.
$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$
(4)
где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E NC — это эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E NY — это эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ N — квантовая эффективность NanoLuc, а f N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc.
Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP: E NC , был также оценен по формуле. 4, установка E NY и E CY как ноль.
Покадровая визуализация культивируемых клеток
Покадровая съемка была получена и обработана с использованием, по существу, тех же условий и процедур, что и ранее. 52 .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом в процессе покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).
В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см 2 в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить паразитный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25×36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.
Для визуализации BRET не использовалось дихроичное зеркало.
Обработка изображений
Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума 53 . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона.
На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.
Optogenetics
Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать мембранную транслокацию слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом с длиной волны 490 нм (55 мкВт / см 2 ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8.
На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см 2 ) или светом 490 нм (180 мкВт / см 2 ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).
Анализы на микропланшетном ридере
Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разбавленным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью считывающего устройства для микропланшетов GloMax Discover (Promega).
Фильтр короткого прохода 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $
(5)
Здесь SD — это стандартное отклонение, а Ave — это среднее значение желтого / голубого люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее 26 .
Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$
(7)
Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK — это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.
Образование опухоли ксенотрансплантатом и генерация трансгенных мышей
Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 6 клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации.
Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 5 клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенные мыши были получены с помощью Tol2-опосредованного переноса гена 54 . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.
Биолюминесцентная визуализация всего тела животных
Для сравнения продолжительности жизни биолюминесценции между аналогами целентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для получения люминесцентных изображений мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил-целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас.
/ Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время воздействия 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1.
Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.
Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши
Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому аппарату ИВЛ MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%.
Чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием, обнаженную область левого легкого осторожно отсосали и зафиксировали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был подключен к вакуумному насосу. Опухоли в легких получали с помощью вертикального микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного водно-иммерсионным объективом XLPlanN 25x (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. В качестве дихроичных зеркал использовали DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Используемые фильтры выбросов: FF01-425 / 30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET, соответственно. Во время визуализации FRET мышам внутривенно вводили 5,0 мг кг -1 PD-0325901 без прерывания визуализации.
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.
Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.
Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Протеазный анализ для двухфотонной кросс-корреляции и FRET-анализ, основанный исключительно на флуоресцентных белках
Реферат
GFP и красный флуоресцентный белок, DsRed, были объединены для разработки анализа протеазы, который позволяет не только проводить исследования резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), но и проводить двухцветный кросс-корреляционный анализ, метод на основе одной молекулы, который избирательно исследует одновременное движение двух разных тегов.Принцип измерения основан на обнаружении со спектральным разрешением одиночных молекул, диффундирующих в дифракционно-ограниченном лазерном фокусе и из него. Молекулы субстрата с двойной меткой разделяются на два продукта с одной меткой путем специфического расщепления в сайте расщепления протеазой между двумя фланкирующими метками, DsRed и GFP, тем самым нарушая совместные колебания в двух каналах обнаружения и завершая FRET между двумя метками.
В отличие от ферментных анализов, основанных исключительно на FRET, этот метод двухцветной кросс-корреляции не ограничен определенным диапазоном расстояний между флуорофорами и является гораздо более универсальным в отношении возможной конструкции субстрата.Для упрощения измерительной установки использовалось двухфотонное возбуждение, позволяющее одновременно возбуждать обе метки одной длиной волны инфракрасного лазера. Общая концепция была экспериментально подтверждена с помощью конструкции GFP – пептид – DsRed, содержащей сайт расщепления протеазой вируса травления табака. Двухфотонное возбуждение в инфракрасном диапазоне и использование клонируемых меток делают этот анализ легко адаптируемым для внутриклеточных приложений. Более того, сочетание FRET и кросс-корреляционного анализа в подходе на основе одной молекулы обещает захватывающие перспективы для миниатюрного высокопроизводительного скрининга на основе флуоресцентной спектроскопии.
Белковые взаимодействия стали важной темой в биохимии в постгеномную эру.
С ростом числа новых белков, выявленных в результате геномных исследований, и последующей задачей определения их функций, были разработаны новые технологии для приложений in vivo, и высокопроизводительного скрининга. Конфокальное обнаружение в сочетании с анализом редких или единичных флуоресцентных молекул в водной среде (1–3) в настоящее время считается одним из наиболее многообещающих инструментов из-за его высокой чувствительности, относительной неинвазивности и низкого расхода образцов.На основе флуоресцентных репортерных молекул, обычно белков или нуклеиновых кислот, помеченных синтетическими красителями, эти инструменты позволяют разнообразным биологическим процессам стать доступными для чувствительных биофизических методов. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) (1, 4, 5), один из наиболее известных из этих методов, анализирует мельчайшие спонтанные флуктуации эмиссионного поведения малых молекулярных ансамблей, которые отражают лежащую в основе межмолекулярную и внутримолекулярную динамику.
Поскольку FCS наблюдает флуоресцентные молекулы в наномолярном диапазоне, он может давать информацию, точно имитирующую реальные физиологические условия, о различных процессах, таких как реакции ассоциации и диссоциации, перенос, ферментативные обороты биохимических субстратов и внутримолекулярные (например,g., структурная) динамика в широком диапазоне разрешения в пространстве и времени.
Один из наиболее многообещающих спектроскопических инструментов для изучения белок-белковых взаимодействий в живой клетке, резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), недавно был использован для разработки эффективных внутриклеточных лиганд-связывающих (6) и протеазных анализов (7). . Здесь о клеточных процессах можно судить по спектральным изменениям сигнала излучения из-за зависящей от расстояния передачи энергии от возбужденного донорного красителя к длинноволновому акцептору.Благодаря своей высокой специфичности FRET оказался полезным для исследования молекулярных взаимодействий и конформационных изменений даже в масштабе одной молекулы (2, 8).
Однако, поскольку FRET требует пространственных расстояний между донорными и акцепторными красителями, как правило, 20-60 Å (8), это накладывает фундаментальный предел на зондирование молекулярных взаимодействий или образования или разрыва связей (т.е. для индикации активности фермента).
Анализ двухцветной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии (dcFCCS) (9) позволяет обойти это ограничение, регистрируя сопутствующие флуктуации сигнала из конфокального объема детектирования в двух спектрально различных каналах излучения и позволяет зондировать чрезвычайно низкие концентрации флуорофора с временным разрешением до десятков наносекунд.В режиме одной молекулы совпадающие флуктуации сигнала в обоих каналах обнаружения однозначно указывают на наличие прочных химических или физических связей между флуорофорами. Ранее это успешно использовалось для количественного изучения эндонуклеолитического расщепления двунитевой двухцепочечной ДНК (дцДНК) в режиме реального времени (10, 11).
Ограничивая параметры считывания либо амплитудами кросс-корреляции, либо измерениями совпадений, скорость анализа может быть улучшена в соответствии со стандартами высокопроизводительного скрининга, обеспечивая надежные оценки типа «да» или «нет» в течение нескольких секунд времени выборки (12).Кроме того, dcFCCS недавно был применен для изучения внутриклеточных явлений, таких как эндоцитоз (13).
Двухфотонное возбуждение (TPE) в сочетании с dcFCCS дает особые преимущества для внутриклеточных применений, таких как ограничение повреждения клеток и потребления образцов путем фотообесцвечивания, аналогично аналогичным in vivo двухфотонным экспериментам FCS (14, 15). TPE возникает только в непосредственной близости от фокального пятна за счет квазиодновременного поглощения двух фотонов ближнего инфракрасного диапазона.Поскольку для вероятностей переходов между основным и возбужденным состояниями применяются разные правила выбора четности, спектры двухфотонного возбуждения могут значительно отличаться от соответствующих однофотонных спектров.
Следовательно, еще одним существенным преимуществом двухфотонного возбуждения является возможность одновременного возбуждения спектрально различных красителей с одной и той же длиной волны инфракрасного излучения.
С момента появления клонируемых флуоресцентных меток, таких как GFP, наиболее привлекательными анализами, особенно с точки зрения внутриклеточной применимости, безусловно, являются те, которые могут быть полностью адаптированы к таким репортерным системам «живого цвета», поскольку их вмешательство в организм может быть сведены к минимуму.Однако до сих пор разработка полностью белкового фермента или анализа связывания с белками для возможного использования с dcFCCS или другими видами анализа одиночных молекул в живых клетках, однако, ограничивалась отсутствием подходящих пар флуоресцентных белков, которые соответствуют необходимым критериям для анализа, т. е. в значительной степени разные спектры излучения, но схожая фотостабильность. В этом исследовании мы представляем доказательство принципа того, что современная двухцветная технология FCCS в сочетании с TPE действительно может быть применена к генетически кодируемым флуоресцентным меткам для выполнения кинетического ферментного анализа на уровне одной молекулы.
Для достижения этой цели был создан комбинированный ферментный анализ FRET / кросс-корреляции на основе GFP с красным смещением (rsGFP) (16) и DsRed (17), соединенных коротким белковым линкером длиной 32 аминокислот (см. Рис. 1 a ). ), содержащий целевой сайт rTEV, рекомбинантного фрагмента протеазы вируса травления табака (TEV) (18). При расщеплении протеазой отделение флуоресцентных белков от репортерной конструкции контролировали количественно с помощью двухцветной кросс-корреляции, которая позволяет различать различные концентрации фермента в наномолярном диапазоне (см.рис.1 б ). Эффективность FRET субстрата одновременно наблюдалась во время протеазного расщепления путем регистрации выхода молекулярных фотонов в секунду, обеспечивая альтернативный способ мониторинга реакции расщепления. Хотя теоретически эффективность FRET, равная 100%, может серьезно затруднить кросс-корреляционный анализ, мы показываем, что эффективность переноса между 30% и 60% может быть допустимой, если ее правильно скорректировать в анализе данных.
Схематическое объяснение STEV-ST и анализа флуоресцентной протеазы.( a ) Доменная структура STEV-ST. Проиллюстрированы состав и линейное расположение STEV-ST (не в масштабе). Домены rsGFP и DsRed STEV-ST соединены 32-аминокислотным белковым линкером, содержащим последовательность узнавания протеазы из протеазы TEV . С-концевой Strep-Tag II добавляли для очистки белка. Вертикальные числа указывают положение аминокислоты в белке. ( b ) Схематическое изображение, изображающее анализ протеазы на основе STEV-ST.Расщепление пептидного линкера репортерной конструкции протеазой TEV прекращает как FRET, так и кросс-корреляцию из-за разделения флуоресцентных белков.
Эти многообещающие результаты, хотя и получены в контролируемой системе in vitro , ясно демонстрируют, что будущее использование этой или родственных репортерных конструкций in vivo вполне возможно. Решающее преимущество этого анализа, по сравнению с предыдущими анализами одиночных молекул на основе FRET или FCS, состоит в том, что он не полагается на утомительные стратегии флуоресцентного мечения и загрузки клеток.
Материалы и методы
Теоретическая концепция.
Подробное обсуждение теории и применения кросс-корреляционного анализа можно найти в других источниках (9, 19). Нормализованная функция корреляции флуоресценции обычно определяется следующим образом: где F i ( j ) ( t ) — сигналы флуоресценции. Для i = j уравнение. 1 определяет функцию автокорреляции для одного вида молекул в одном канале обнаружения.Если флуктуации флуоресценции разных видов флуоресценции ( i ≠ j ) одновременно регистрируются в двух каналах излучения и взаимно коррелируются, G ij или G x определяет функцию кросс-корреляции. В идеальных условиях с минимальными спектральными перекрестными помехами между красителями и в отсутствие FRET амплитуда кросс-корреляции G x (0) прямо пропорциональна относительной концентрации дважды меченых видов (т.
е., нерасщепленный субстрат в нашем анализе протеазы). Абсолютная концентрация субстрата с двойной меткой может быть получена из соответствующих амплитуд автокорреляции в соответствии с: с V eff , являющимся эффективным объемом обнаружения. При отсутствии видов с двойной меткой G x (0) равняется нулю.
Опять же, в идеализированных условиях временное затухание кросс-корреляционных кривых можно оценить с помощью трехпараметрической модели для одного диффундирующего вещества (19): где τ D = r / 8D определяется как среднее латеральное время диффузии для одиночной молекулы двухкомпонентных частиц в случае двухфотонного возбуждения.Здесь r 0 и z 0 — характерные поперечный и осевой размеры элемента эффективного фокусного объема V eff = (π / 2) 3/2 r z 0 . Таким образом, с известным V eff , локальная концентрация флуоресцентных молекул 〈C i 〉 может быть определена путем рассмотрения автокорреляционных амплитуд согласно 〈C i 〉 = G (0) ⋅ V .
С другой стороны, размер V eff можно определить путем калибровочных измерений с чистым красителем с хорошо известным коэффициентом диффузии.
Если двухцветный анализ сочетается с FRET между отдельными флуорофорами, оценка как авто-, так и кросс-корреляционных амплитуд должна быть изменена. В этом случае необходимо учитывать молекулярную яркость η, измеряемую в фотонах на молекулу в секунду. Для определенного красителя η обычно можно определить в стандартных измерениях FCS путем умножения соответствующей амплитуды автокорреляции, обратно пропорциональной количеству наблюдаемых молекул, на среднюю скорость счета флуоресценции (9).Если η i , F и η j , F обозначают значения яркости в присутствии FRET (в нашем анализе нерасщепленной кросскоррелирующей подложки), а η i и η j описывают значения яркости красителей, не затронутых FRET (в нашем анализе, расщепленных фрагментов), амплитуды авто- и кросс-корреляции изменяются на: Чтобы оценить общий эффект FRET на корреляционные амплитуды, мы введите параметры f i = η i , F / η i и f j = η j , F / η j .
Относительные амплитуды при наличии и отсутствии FRET могут быть записаны как:
Автокорреляция: Кросс-корреляция: где x = C ij / C 0 — фактическая относительная доля кросс-коррелирующего (т. Е. Нерасщепленного) субстрата по отношению к исходной концентрации субстрата C 0 . Поправочный коэффициент для правильной оценки амплитуд, следовательно, является динамическим, зависящим от относительных концентраций и стадии реакции.
Можно проверить, что для многих комбинаций f i / f j , в частности, если происходит резкое тушение донора или усиление акцептора, соотношение между двумя амплитудами G x (0) с FRET и без него очень нелинейный. Следовательно, если необходимо получить абсолютные концентрации видов с двойной меткой, правильная коррекция требует экспериментального контроля как f i , так и f j .
Количественное соотношение между G x, FRET (0) и абсолютной концентрацией двухцветных частиц C ij определяется по формуле:
Материалы.
Протеолитические анализы проводили с использованием протеазы rTEV [29 кДа (18)], закупленной у GIBCO / BRL, с активностью 10 единиц / мкл (1 единица соответствует 100 нг или 3,5 пмоль фермента, как определено производителем). ПЦР-амплификации выполняли с использованием системы Expand High Fidelity PCR System (Roche Applied Science, Мангейм, Германия).Для целей клонирования использовали Escherichia coli, XL1-blue; экспрессию белка проводили с помощью E. coli, BL21 (DE3) (Stratagene). Стреп-тактин-сефароза и олигонуклеотиды были получены от IBA (Геттинген, Германия). Наборы для ПЦР-очистки и гель-экстракции были закуплены у Qiagen (Hilden, Германия).
Плазмидные конструкции.
Для создания гибридного белка rsGFP и DsRed, связанного сайтом-мишенью rTEV (из нативной последовательности полипротеина TEV ) (из нативной последовательности полипротеина TEV ) (аминокислоты 2781–2797, Национальный центр биотехнологической информации, номер доступа
) была использована стратегия многоступенчатого клонирования.
). Кодирующую последовательность rsGFP амплифицировали из pQBI63 (Q-BIOgene, San Diego) с помощью ПЦР и клонировали в плазмиду pDsRed (CLONTECH) перед кодирующей последовательностью DsRed. Фрагмент ДНК, кодирующий линкерную область полипротеина TEV (аминокислотная последовательность, QSTLEDPDIPTTENLYFQSGTVDADPRVPVAT), вставляли в сайт рестрикции BamH I между rsGFP и DsRed. Сгенерированную конструкцию клонировали в бактериальный экспрессирующий вектор pASK-IBA3 (IBA) на 21 п.н. выше C-концевой Strep-Tag II.Полученный ген (1554 п.н.) был назван STEV-ST (S для короткой линкерной области из 32 аминокислот и -ST для Strep-Tag II).
Очистка белков.
Для экспрессии белка pSTEV-ST трансформировали в E. coli, BL21 (DE3), используя электропорацию. Жидкие культуры инокулировали 500 мкл ночной культуры, выращивали при 37 ° C до 0,5 A 550 и индуцировали 0,2 мкг / мл ангидротетрациклина (IBA). Через 5 часов при 25 ° C клетки собирали при 4000 × г в течение 15 минут и ресуспендировали в 8 мл буфера W (100 мМ Tris⋅HCl, pH 8..jpg)
0/150 мМ NaCl / 1 мМ MgCl 2 ). Осадок клеток лизировали с использованием французского пресса и осветляли центрифугированием при 23,420 × g в течение 45 мин. Супернатант наносили на колонку Strep-Tactin Sepharose (объем слоя 2 мл; гравитационный поток; IBA), уравновешенную в буфере W. Колонку промывали 5 мл буфера W, и слитый белок элюировали буфером W плюс 2,5. мМ дестиобиотин (IBA). Фракции (0,5 мл), содержащие как зеленую, так и красную флуоресценцию, объединяли, концентрировали с помощью концентраторов отсечки молекулярной массы Vivaspin 50 000 (Sartorius) и инкубировали при комнатной температуре в течение 48 часов, чтобы обеспечить полное созревание флуорофора.Концентрация STEV-ST определялась с использованием DsRed = 75000 / M⋅cm при 558 нм (19) и ɛ rsGFP = 42,933 / M⋅cm при 490 нм (CLONTECH) вместе с анализом белка BCA и SDS / СТРАНИЦА.
Конечный продукт на 80% состоит из полностью функционального STEV-ST и его производных в результате частичной деградации или неполного созревания флуорофора, тогда как после SDS / PAGE наблюдалась неспецифическая примесь примерно 20%.
Вышеуказанные измерения концентрации белка и анализ FCS (см. Ниже) показали 50% -ный избыток неспаренных (только красных) молекул DsRed и что 50% очищенного белка было функциональным STEV-ST.Из-за С-концевой аффинной метки неспаренные фрагменты белка rsGFP не очищались.
Протеолитический анализ.
Протеазные реакции проводили в объемах 15 мкл в восьмилуночных камерах (Nunc) в условиях, указанных производителем. И флуоресцентный субстрат, и протеаза были разбавлены до соответствующих концентраций непосредственно перед анализом: 10 единиц rTEV и 4,5 мкМ STEV-ST для спектрального анализа и 0,4, 0,6, 1,3 и 2.5 единиц rTEV (69, 118, 236, 437 нМ rTEV) и 110 нМ STEV-ST для измерений FCCS. Реакции проводили при комнатной температуре и инициировали добавлением rTEV. Рис. 1 a иллюстрирует состав и расположение различных компонентов STEV-ST. Реакция расщепления rTEV дает rsGFP массой 29,0 кДа и фрагмент DsRed массой 29,2 кДа из слитого белка массой 58,2 кДа.
Экспериментальная установка.
Измерения двухфотонной кросс-корреляционной спектроскопии проводили на инвертированном микроскопе Olympus (Гамбург, Германия) IX-50 (рис.2, исх. 11). Двухфотонное возбуждение достигалось с помощью перестраиваемого титанового / сапфирового лазера с импульсной синхронизацией мод и частотой 80 МГц (100 фс) (Spectra-Physics). Задняя апертура объектива (UPlanApo 60 ×, 1,2 NA, Olympus) была слегка переполнена, чтобы создать ограниченное дифракцией фокусное пятно. Размер элемента эффективного объема в этой установке составляет ≈ 0,25 фл (11). Излучаемый свет с длиной волны около 550–700 нм от DsRed и 490–550 нм от rsGFP (спектры одиночного излучения не показаны) коллимировали, разделяли дихроичным зеркалом (530 DCLP, AHF, Тюбинген, Германия) и регистрировали двумя оптическими лавинные фотодиоды с волоконной связью (SPCM-200, EG&G, Vaudreuil, PQ, Canada) после прохождения полосового фильтра D620 / 100 (AHF) в DsRed и полосового фильтра HQ525 / 50M (AHF) в канале обнаружения rsGFP.
Для одноцветных калибровочных измерений эмиссионного фильтра 600DF200 (AHF) было достаточно для подавления инфракрасного возбуждающего света. Конфокальные спектры получали с помощью волоконно-связанного спектрометра (Ocean Optics, Данидин, Флорида) с использованием входной щели волокна 100 мкм. Цифровые импульсы лавинных фотодиодов обрабатывались, и время коррелировалось с помощью карты многократного τ-коррелятора ALV-5000 (ALV, Ланген, Германия).
Оптическая установка, реализованная в инвертированном микроскопе Olympus IX-50.Для освещения используется одна линия титан-сапфирового лазера с настраиваемой длиной волны. Излучаемый свет разделяется дихроичным зеркалом за коллимирующей линзой и отображается на двух разных оптических волокнах. Оба волокна могут быть альтернативно подключены к спектрометру.
Результаты
Спектральный анализ и калибровочные измерения теста под TPE.
Выбор подходящих комбинаций красителей для двухфотонной кросс-корреляционной спектроскопии был основан на квантовых выходах, спектрах двухфотонного поглощения и фотостабильности, поскольку интенсивность возбуждения не может быть настроена независимо для обоих красителей.
Чтобы проверить пригодность rsGFP и DsRed для одновременного TPE, их сигналы излучения сначала были записаны в одноцветной установке с возбуждением на разных длинах волн от 800 до 1000 нм (рис. 3 a ). В оптимальных условиях возбуждения, близких к насыщению, но все же ниже уровня фотообесцвечивания, выбросы достигают максимума при возбуждении 940 нм (rsGFP) и 960 нм (DsRed). Максимальный выход фотонов составлял 20 кГц / молекулу для rsGFP и 12 кГц на молекулу для DsRed. Поскольку rsGFP использовался в качестве донора FRET в описанном анализе протеазы, условия возбуждения были настроены в пользу этого красителя.Таким образом, оптимальная длина волны для совместного возбуждения обоих флуорофоров в измерениях FRET / кросскорреляции, описанных ниже, составляла 940 нм. Максимальная интенсивность 20 мВт на этой длине волны давала достаточное возбуждение для обоих красителей.
Характеристика анализа протеазы STEV-ST. ( a ) Зависимость выхода флуоресценции η от длины волны для rsGFP и DsRed при двухфотонном возбуждении.
Выходы фотонов на молекулу измеряли в одноцветной установке (без хроматического расщепления луча) в условиях, близких к насыщению, но значительно ниже фотообесцвечивания.Оба флуорофора эффективно возбуждались TPE с пиковым излучением при 940 нм для rsGFP (20 кГц на молекулу) и 960 нм для DsRed (12 кГц на молекулу). Оптимальная длина волны для совместного возбуждения обоих флуорофоров составляла 940 нм с максимальной интенсивностью 20 мВт. ( b ) Протеолитические изменения в спектре излучения STEV-ST в процессе пищеварения. Спектр излучения гибридного белка под TPE при 940 нм (черная линия) соответствует ≈40% FRET. Спектр непрерывно изменяется при инициировании протеолитического переваривания с добавлением rTEV (1.7 мкМ) к субстрату STEV-ST (4,5 мкМ), как показано серыми линиями. Измерения проводились в течение 10 секунд в течение 5 минут.
Для анализа спектральных свойств субстрата гибридного белка в реальных условиях измерения TPE на длине волны 940 нм регистрировали спектр испускания во время протеолитического расщепления STEV-ST в отсутствие всех фильтров испускания с полным фокусным объемом, напрямую связанным с входная щель волоконно-оптического спектрометра (рис.
3 б ). Динамику этого переваривания протеазой отслеживали как совокупное измерение в 4,5 мкМ растворе STEV-ST после добавления 10 единиц rTEV / 15 мкл (1,7 мкМ rTEV) в единичных измерениях продолжительностью 10 с в течение 5 минут. На всех стадиях реакции в спектре наблюдались два отличительных пика около 510 и 580 нм, соответствующих максимумам испускания rsGFP и DsRed соответственно. Протеолитическое расщепление STEV-ST привело к сдвигу спектра излучения и выявило FRET между rsGFP и DsRed в системе.По сравнению со спектром нерасщепленного субстрата в начале реакции, rsGFP показал увеличение почти на 50%, тогда как флуоресценция DsRed соответственно уменьшилась. Количественный анализ спектров только слитого белка и красителей показал, что эффективность FRET для интактного субстрата составила почти 40%. На основании числа аминокислот (32 аминокислотных остатка) длина белкового линкера между флуорофорами оценивалась в диапазоне от 58 Å для α-спиральной конформации до приблизительно 100 Å для расслабленной конформации.
FCS-анализ реакции расщепления в режиме реального времени на основе одной молекулы
Автокорреляционный / FRET-анализ.
После того, как была продемонстрирована пригодность комбинации красителей rsGFP / DsRed для двухфотонной кросс-корреляционной спектроскопии и продемонстрирована биологическая функциональность белкового субстрата, флуоресцентный анализ протеазы на основе белков стал предметом измерений FCS в масштабе одной молекулы. В реакционной смеси, содержащей 236 нМ rTEV и 110 нМ STEV-ST, расщепление протеазы контролировали в течение 10 минут со скоростью два измерения в минуту путем записи непрерывных скоростей счета фотонов, соответствующих излучению rsGFP и DsRed, вместе с соответствующими функциями автокорреляции для оба канала обнаружения.Наблюдалось большое увеличение зеленого и уменьшение скорости счета красного, тогда как соответствующие автокорреляционные функции оставались постоянными (рис. 4). Поскольку средняя молекулярная яркость на молекулу η в любой момент времени легко определяется путем умножения амплитуды автокорреляции на скорость счета фотонов, FCS позволяет очень чувствительно контролировать свойства излучения в присутствии и в отсутствие FRET (20).
Как показано на рис. 4, скорость испускания фотонов на одну молекулу увеличивается для rsGFP более чем на 50% с 4.6 кГц (η GFP, FRET ) в начале ферментативной реакции до 7 кГц (η GFP, noFRET ) в конце. Это увеличение соответствует примерно 35% передачи энергии в интактном субстрате, что достаточно хорошо согласуется со значением 40%, определенным из анализа спектров излучения при более высоких концентрациях субстрата и фермента.
FRET в масштабе одной молекулы. Автокорреляционные функции и количество фотонов на молекулу в кГц ( вставка ) для rsGFP и DsRed определяли параллельно во время инкубации 110 нМ STEV-ST с 197 нМ rTEV.Изменения интенсивности флуоресценции донора FRET (rsGFP) и акцептора (DsRed) были обнаружены сразу после добавления фермента, тогда как значения автокорреляции G (0) и количество флуоресцентных частиц оставались постоянными. Наблюдаемое увеличение флуоресценции rsGFP соответствует примерно 35% FRET в интактном субстрате.
Оценка η DsRed была несколько более сложной из-за превышения в нашем образце неспаренных фрагментов DsRed на ≈50%.Присутствие протеолизированных фрагментов DsRed подтверждалось по 2-кратному снижению амплитуды автокорреляции в красном канале по сравнению с зеленым каналом. Следовательно, значение η DsRed, FRET не эквивалентно η DsRed, 0 в начале процесса расщепления. Если n флуоресцентный образец с разными значениями яркости η n представлен на одной автокорреляционной кривой FCS, средняя яркость 〈η〉 определяется как 〈η〉 = ∑ n C n η / ∑ n C n η n , где C n — относительные концентрации.Таким образом, в смеси FRET-активных парных и FRET-неактивных неспаренных частиц DsRed с η DsRed, noFRET = 6,7 кГц / молекула, известная из измерений конечных точек, η DsRed, FRET = 8,1 кГц / молекула было получено из средняя скорость счета η DsRed, 0 = 7,5 кГц / молекула в момент времени 0.
То, что уменьшение флуоресценции DsRed после прекращения FRET составляет всего 20%, по сравнению с увеличением на 35% для GFP, можно объяснить прямым акцептором. возбуждения и сложной фотофизической природы DsRed (21), предполагая, что энергия рассеивается при переходе от GFP к временно нефлуоресцентному состоянию акцептора.
Замечательная согласованность амплитуд автокорреляционных функций на протяжении протеолитического расщепления показывает, что практически не было потери флуоресцентных молекул из-за адсорбции или фотодеградации. Одним из наиболее важных следствий этого постоянства является исключение значительной олигомеризации DsRed в слитом белке. Если субстрат DsRed-пептид-GFP содержал DsRed в виде димера или тетрамера, как предполагалось в предыдущих исследованиях (22), протеолитическое расщепление, скорее всего, увеличило бы количество высвобождаемых частиц GFP.Таким образом, стабильность амплитуды автокорреляции GFP указывает на полное отсутствие мультимеров среди наблюдаемых (флуоресцентных) молекул субстрата.
Кросс-корреляционный анализ при наличии FRET.
Расщепление STEV-ST приводит к диссоциации двух флуорофоров (рис. 1 b ) и, следовательно, к спаду амплитуды кросс-корреляции. На рис. 5 показан график кросс-корреляционных кривых, снятых в течение 380 с для образца, содержащего 110 нМ STEV-ST и 437 нМ rTEV.Зеленую и красную флуоресценцию измеряли непрерывно, а кросс-корреляционный анализ выполняли с интервалами 40 с (низкие концентрации фермента) и 20 с (высокие концентрации фермента).
Рис 5.Кривые кросскорреляции, измеренные во время реакции протеолитического расщепления. 110 нМ STEV-ST инкубировали с 437 нМ rTEV при комнатной температуре. Кривые были усреднены из двух последовательных 20-секундных измерений каждое и подогнаны по формуле. 3. В ходе реакции амплитуды G (0) постепенно уменьшались, тогда как соответствующие времена диффузии оставались постоянными, обеспечивая идентичность субстрата.
Спад амплитуд кросс-корреляции G x (0) очень напоминает уменьшение концентрации интактного субстрата C ij .
Однако при наличии FRET не существует простой линейной зависимости между G x (0) и C ij . Скорее, определение абсолютных концентраций субстрата требует как амплитуд автокорреляции, так и скорости счета флуоресценции (т.е.е. параметры яркости η, как указано в Theory ). Уравнение 6 описывает величину этого эффекта, которая зависит от параметров f i = η i, F / η i и f j = η j , F / η j для сравнения эмиссионных свойств обоих флуорофоров в присутствии ( F ) и в отсутствие FRET. Из значений, определенных выше, η GFP, FRET = 4.6 кГц, η GFP, noFRET = 7 кГц, η DsRed, FRET = 8,1 кГц и η DsRed, noFRET = 6,7 кГц, мы оценили f rsGFP = 0,66 и f DsRed = 1,2 для нашей системы.
На рис.
6 показано общее влияние различных теоретических случаев FRET (выраженных в терминах f DsRed и f GFP ) на относительные амплитуды кросскорреляции G x, FRET (0) / G x, без FRET (0).Выделены экспериментальные условия для анализа GFP / DsRed, описанные здесь. Видно, что наличие FRET в нашем случае приводит к недооценке относительной доли субстрата, которая становится тем серьезнее, чем меньше субстрата остается. Для всех комбинаций f i / f j ниже линии 1/1 присутствие FRET обычно подчеркивает изменения в режиме высоких относительных концентраций видов с двойной меткой. Для комбинаций выше линии 1/1 относительные изменения в режиме низких концентраций кросс-коррелирующих частиц более выражены.Для амплитуд автокорреляции также может наблюдаться небольшой эффект, вызванный FRET, как показано на вставке к рис. 6. Однако для комбинации f rsGFP = 0,66 и f DsRed = 1,2, как вычислено.
для нашего анализа не ожидается никаких значительных изменений (менее 5% для rsGFP, менее 1% для DsRed). Эффект слишком мал, чтобы быть видимым за пределами шума на корреляционных функциях на рис. 4, что объясняет их кажущееся постоянство.
Моделирование относительных амплитуд G x, FRET (0) / G x, NoFRET (0) для различных концентраций x дважды меченого FRET-субстрата во время протеолитического переваривания. В начале реакции x = 1. Относительная амплитуда взаимной корреляции, определяющая влияние FRET на анализ данных FCS, изменяется во времени дайджеста и зависит от индивидуальных соотношений f = η без изменений / η расщепляет для обоих флуорофоров соответственно.Из наших измерений FRET мы получили f GFP = 0,66 и f DsRed = 1,2 для STEV-ST (▪). ( Вставка ) Влияние FRET на амплитуды автокорреляции, предполагая то же самое f i .
Для количественного определения ферментативного расщепления реакции расщепления STEV-ST проводили при концентрациях rTEV 69, 118, 236 и 437 нМ и 110 нМ STEV-ST, на 3 порядка ниже K M = 69 мкМ предложено Parks et al. (18). G x (0) значения получали со скоростью 2–3 измерения в минуту в течение 6–10 минут реакции. Абсолютные концентрации субстрата в заданное время (рис. 7) определяли в соответствии с уравнениями. 2–6. Из-за полного перекрытия объемов обнаружения и минимальных спектральных перекрестных помех менее 10% (данные не показаны) экспериментальная ошибка определялась исключительно неопределенностью конкретной маркировки. По оценкам, это было менее 5% на основе меченных GFP, FRET-активных молекул субстрата.
Рис 7.Кинетика реакции протеолитического расщепления при различных концентрациях фермента. Протеолитические реакции проводили при комнатной температуре с использованием 110 нМ STEV-ST. Концентрации ферментов в диапазоне от 69 до 473 нМ были легко различимы, особенно по их начальным скоростям реакции (см. , вставка ). Начальные скорости реакции были получены из точек данных в первые 60–180 с реакции путем линейной регрессии после корректировки амплитуд FRET, как описано.
Концентрации фермента, отличающиеся менее чем в 2 раза, можно легко отличить по ходу реакции и более количественно от начальных скоростей реакции (рис. 7 , вставка ). Для отрицательного контроля (без фермента) в течение 10-минутного измерения не было обнаружено уменьшения сигнала кросс-корреляции. Как видно на фиг. 5, амплитуда кросс-корреляционной функции не снижалась ниже ≈20% от ее начального значения даже при более длительном времени реакции, указывая на то, что остаточное количество кросс-коррелирующего субстрата не подвергалось влиянию процесса расщепления.Поскольку сайт-мишень протеазы фланкирован двумя довольно большими глобулярными доменами, сайт расщепления мог быть не полностью доступен в этой остаточной фракции.
Резюме и заключение
Протеазный анализ, подходящий для двухцветной двухфотонной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии в масштабе одной молекулы, был разработан исключительно на основе генетически кодируемых меток. Этот специально разработанный субстрат слитого белка, STEV-ST, состоит из rsGFP-пептид-DsRed с сайтом расщепления протеазы TEV в пептидной области и демонстрирует ослабление перекрестной корреляции, а также FRET между флуорофорами во время ферментативного расщепления при мониторинге в в реальном времени.Существует огромная потребность в альтернативных и универсально применимых системах для измерения внутриклеточных молекулярных взаимодействий и определения кинетики реакции белков и ферментов, особенно в отношении выяснения функции белков и приложений для высокопроизводительного скрининга.
Комбинация TPE, FCS / FCCS и FRET в сочетании с анализом белковых флуоресцентных субстратов для мониторинга протеолитической деградации приводит к чрезвычайно чувствительному и селективному методу отслеживания динамических процессов в физиологических условиях в реальном времени. поддается адаптации для сотовых приложений.Ограничения, накладываемые альтернативными методами, такими как стандартный FRET, в отношении расстояний между флуорофорами, могут быть преодолены путем использования двухцветной кросс-корреляции, которая учитывает динамическое сопутствующее движение молекул красителя независимо от их размера и близости. . По сравнению с предыдущей работой с использованием двухфотонных измерений FCCS с синтетическими красителями (11), комбинация флуоресцентных белков, DsRed и rsGFP, по-видимому, хорошо подходит для одновременного возбуждения с помощью TPE.DsRed, несмотря на его медленное созревание и тенденцию к агрегации в качестве нативного белка, хорошо работал в слитой конструкции, будучи связанным с фрагментами белка как на его N-, так и на C-конце. В заключение, это исследование представляет собой доказательство принципа распространения приложений двухфотонной кросс-корреляционной спектроскопии на белковые репортерные молекулы с перспективой применения этой технологии для диагностики, скрининга и биологических исследований клеток.
Благодарности
Мы благодарим Майкла Янца, Эльке Хаустейн и Петру Диттрих за полезные обсуждения; Карин Биркенфельд за помощь в подготовке проб; и Салли Ким за критическую корректуру.Благодарим за финансовую поддержку Министерства образования и исследований Германии (гранты Biofuture 0311845 и 16SV1257) и Evotec BioSystems AG (Гамбург, Германия). Структурные данные для рис. 1 b были получены от Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (www.rcsb.org/pdb/; ID: 1G7K; 1EMF) и визуализированы с помощью расмола (www.umass.edu/microbio/rasmol/ ).
Сокращения
rsGFP, с красным смещением GFP
TPE, двухфотонное возбуждение
FRET, резонансный перенос энергии флуоресценции
dcFCCS, двухцветная кросс-корреляционная спектроскопия флуоресценции
дцДНК, двухцепочечная ДНК
FCS, флуоресцентная корреляционная спектроскопия
TEV, вирус травления табака
- Поступила 31 марта 2002 г.
- Принято 22 июля 2002 г.
- Copyright © 2002, Национальная академия наук
Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU
Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов. В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов.Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом исследования взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале.Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.
Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и излучения, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, по-видимому, совпадают (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.
Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же соседстве, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Визуализация флуоресценции с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает от относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.
Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применяя методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на рисунке , ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная эмиссия имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.
Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привели к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.
Флуоресцентные белковые биосенсоры
Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C oplementation; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.
Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция под названием cameleon , созданный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием той же матрицы включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP (названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов в начало седьмой beta -цепи в основной цепи флуоресцентного белка.Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных концов N и C и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками, могут быть слиты с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.
Рисунок 2 — Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения активности протеазыЗа биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на изменениях протонирования нативного (дикого типа) GFP, которые приводят к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут регистрировать активность киназы в режиме реального времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.
Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рис. 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать датчик во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.
Основные принципы FRET
Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.
Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансной передаче энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.
Рисунок 3 — Переменные коэффициента расстояния и ориентации Фёрстера в FRETФеномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):
Formula 1 — Эффективность FRETE FRET = 1 / [1 + (правый / правый 0 ) 6 ]
, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое может быть вычислено для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Ферстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний меньше R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний больше R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на рисунке 3 (а) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET можно эффективно использовать в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только с высоким FRET и с низким FRET или просто между наличием и отсутствием FRET.
Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или забуференном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:
Формула 2 — R (0)R 0 = [2,8 x 10 17 × Κ 2 × Q D 3 9066 9066 9066 9066 × J (λ)] 1/6 нм
, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. Рисунок 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) — квантовый выход донора, Ε (A) — максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) — интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$
Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами во многом так же, как положение радиоантенны может влиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень выравнивания определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может варьироваться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Почти для любой реалистичной ситуации (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы отрегулировать это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, которые может привести к драматическим эффектам).Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.
Рисунок 4 — Интеграл спектрального перекрытия возбуждения и излученияСледует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, которые возникают из-за изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.
Факторы, влияющие на измерения FRET
На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как другой канал будет доминировать с систематическим шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.
Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET.В связи с тем, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по межбелковому взаимодействию, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия является фиксированной и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.
Наличие сквозного прохождения (также называемого перекрестными помехами и кроссовером ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. Рисунок 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора ( Рисунок 5 (a) ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора значительно перекрываются (, рис. 5 (b), ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, которые хорошо разделены спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.
Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имея значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждую из описанных выше проблем можно смягчить (или частично) путем осознанного выбора пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.
Рисунок 5 — Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRETПредставлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET.Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, фиг. 5 (a), ), так и в спектрах излучения (, фиг. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (а) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP ( Рисунок 5 (b) ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всей области излучения mVenus.
Методы FRET в приложениях клеточной биологии
Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, потому что каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, производимых в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:
- Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
- Фотообесцвечивание акцептора — Также известный как декушение донора , этот метод измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
- Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — Измерение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
- Спектральная визуализация — Возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
- Флуоресцентная поляризационная визуализация 909 — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум
Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.
Сенсибилизированная эмиссия
Также обычно называемый двухцветным изображением с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.
Для сенсибилизированной эмиссионной FRET-визуализации были разработаны различные корректирующие подходы. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.
Рисунок 6 — Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRETНесмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированная эмиссия является особенно привлекательной техникой при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, проиллюстрированный на Рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля при ферментативном расщеплении пептидного линкера. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.
Акцепторное фотообесцвечивание
Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и чтобы акцептор фотообесцвечивался примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.
Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормирования этого значения на интенсивность донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, ограничивая его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.
Представлено в Рис. 6 представляют собой примеры FRET-анализа сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцептора с использованием визуализации живых клеток. На фиг. 6 (a) показана эпителиальная клетка карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующая биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) в фигуре , фиг.6 (d) — (f), , были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фигура 6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фигура 6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и нацелен на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рис. 6 (e) ) увеличивает расщепление донора (увеличение зеленой флуоресценции на рис. 6 (f) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале Только.
Флуоресцентная микроскопия для визуализации на протяжении всей жизни (FLIM)
Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.
Рисунок 7 — Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET-микроскопииFLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в области наносекундного срока службы являются сложными, а оборудование является дорогостоящим в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Более того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеренное время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.
Спектральная визуализация
Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но и различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.
Метод построения спектральных изображений требует специального оборудования, но превосходные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычному флуоресцентному микроскопу по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Основным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.
Проиллюстрировано в . Рисунок 7 (a) — это изменения в спаде времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет собой энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль эмиссии от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (приблизительно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивности на 475 и 529 нанометрах этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.
Отображение поляризационной анизотропии
Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом выбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, то излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.
Рисунок 8 — Изображение поляризационной анизотропии FRETОсновная сила этого подхода — простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал / шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображений, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку это может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET следует ограничивать получением изображений с помощью объективов с числовой апертурой 1,0 или меньше.
Представлено в Рисунок 8 — графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков (, рис. 8 (a), ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается во временной шкале эксперимента ( рис. 8 (b), ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( рис. 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансная передача энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.
Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET
Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки могут использоваться для маркировки компонентов мембраны для изучения явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. сеточка. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от примерно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке разделить донорную и акцепторную флуоресценцию. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.
Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (называемый бета -ствол или бета -кан ) и состоящий из полипептида с обширной водородной связью beta -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. фиг.9, ).Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9, ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.
Рисунок 9 — Архитектурные особенности флуоресцентного белкаВысокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации.Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных у рифовых кораллов и анемонов. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локализованная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы позволить димеризацию. Это может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут дать сложные наборы данных, которые иногда могут быть скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков Aequorea в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.
Токсичность — это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченых клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации.Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.
Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным агентом для инактивации специфических белков с помощью хромофорной инактивации света ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако длительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.
В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов пригодны для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа в сравнении с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.
Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners
За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (примерно от 450 до 650 нанометров), таким образом заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. во всех цветовых классах. Недавние успехи в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы по разработке белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. , таблица 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей спектральной области, и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки могут быть легко отображены в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.
Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в паре с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета проявляет более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с CFP Aequorea и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки в голубом спектральном классе. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP, названный CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ), был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого цвета. и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.
Введение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные супер CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных тегов слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нанометров соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую же яркость, что и Cerulean.
Таблица 1 — Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET| Белковая пара | Максимум возбуждения донора (нм) | Максимум эмиссии акцептора (нм) | Квантовый выход донора | Коэффициент молярной экстинкции акцептора | Яркость Фёрстера | Расстояние Фёрстера | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| EBFP2-mEGFP | 383 | 507 | 0.56 | 57,500 | 4,8 | 1: 2 | |||||||
| ECFP-EYFP | 440 | 527 | 0,40 | 83,400 | — | 4,9 | Venus 4 | 528 | 0,62 | 92,200 | 5,4 | 1: 2 | |
| MiCy-mKO | 472 | 559 | 0,90 | 559 | 0,90 | 51,600 | м | 492 | 528 | 0.85 | 92,200 | 5,1 | 1: 1 |
| CyPet-YPet | 477 | 530 | 0,51 | 10424 000 | 5,1 | 46 | |||||||
| 1: 4,5G | 915her 9154610 | 0,60 | 72,000 | 5,1 | 2,5: 1 | ||||||||
| Венера-mЧерри | 528 | 610 | 0,57 | 610 | 0,57 | 72,000 | 5,71547 915d: | 528 | 581 | 0.57 | 138,000 | 5,9 | 1: 2 |
| Venus-mPlum | 528 | 649 | 0,57 | 41,000 | 5,2 | 13154 7 970347 7 На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно было создано новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Полученный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальным альтернативным партнером FRET, излучающим зеленый цвет, для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нанометрах и излучение при 505 нанометрах. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах. Желтые флуоресцентные белки (от 525 нанометров до 555 нанометров) являются одними из наиболее универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны предоставить кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. , Таблица 1 ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации тегов слияния, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния. Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), был также получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом, когда-либо разработанным, и демонстрирует разумную фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой в разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще не установлена. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо сработала с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET). Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известный на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем введения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) демонстрирует спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди всех белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов. Рисунок 10 — Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцепторомНа рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.По мере того как спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (красные и синие заштрихованные области соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей. Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение в экспериментах, требующих повторной визуализации.Тем не менее, mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый цвет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть объединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (под названием mOrange2 ) с резко увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный оранжевый белок, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для локализации и исследований FRET и может оказаться эффективным в большом количестве биосенсорных конструкций. Самый яркий флуоресцентный белок в любом спектральном классе — это тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов при локализации, а также повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Версия тандем-димера (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (в два раза больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах. Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияния, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах по визуализации многоцветных изображений, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям. Красные mFruit белков, mApple , mCherry и mStrawberry (пики излучения на 592, 610 и 596 нанометрах соответственно), имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, представляющих первые настоящие дально-красные генно-инженерные зонды. Наиболее потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рисунок 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих далекую красную флуоресценцию, привело к получению димерного белка, названного Катушка (максимум излучения 635 нанометров). Хотя «Катушка» ярче всего на две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, области, которая важна для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к получению мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра. Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое акцепторное возбуждение. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скорости созревания парных белков. ВыводыХотя эксперименты с FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему обеспечивают наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET с использованием флуоресцентных белков должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут произвести дальнейшую революцию в этом новом подходе к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов. Справочная информация по эвапотранспирации (FRET) для экспериментального прогнозаЧто такое эвапотранспирация и справочная информация по прогнозу эвапотранспирации (FRET)? Эвапотранспирация — это перенос воды с поверхности земли в атмосферу и включает в себя сумму процессов испарения влаги из почвы, водоемов и влажных покрытых растительностью покровов и транспирации влаги из растений.Прогнозы этого важнейшего звена в гидрологическом цикле могут быть очень полезны ирригаторам, муниципальным менеджерам водоснабжения, операторам водохранилищ в целях их планирования и составления графиков, а также эксплуатационным и академическим гидрологам на западе США. Вкратце, уровень эвапотранспирации определяется различными метеорологическими факторами и, что особенно важно, наличием испаряемой влаги. При прочих равных условиях суммарное испарение увеличивается с увеличением солнечного света, скорости ветра и температуры.И наоборот, эвапотранспирация уменьшается с увеличением влажности, но всегда ограничивается ниже преобладающей влажности. Поскольку эта последняя величина в основном неизвестна на территориях, удобных по размеру для водопользователей и сельскохозяйственных пользователей, эти жизненно важные интересы не могут напрямую оценивать, наблюдать или прогнозировать эвапотранспирацию. Вместо этого мы ограничены более простым вопросом: «При четко определенных, идеальных условиях поверхности, сколько воды испарится с поверхности земли в атмосферу?» Чтобы ответить на этот вопрос, мы фиксируем доступность воды, предполагая, что поверхность испарения является хорошо обводненной «эталонной» культурой, а затем оцениваем количество эвапотранспирации, которое могло бы произойти при заданном наборе метеорологических условий.Эта оценка, называемая «эталонной эвапотранспирацией», может затем использоваться ирригаторами или операторами водохранилищ в качестве отправной точки для определения фактической эвапотранспирации в реальных полевых условиях. Показанные здесь прогнозы эвапотранспирации эталонной культуры называются FRET (прогнозируемая эвапотранспирация эталонной культуры) и представлены как наиболее вероятная глубина воды (в дюймах), которая испарится и испарится из эталонной культуры при прогнозируемых погодных условиях в течение дня. и еженедельно. Кроме того, отклонения от нормы представлены для обеспечения исторического контекста для FRET. Раз в два месяца нормы FRET рассчитываются с использованием климатических данных с 1980 по 2009 год. Отклонения от нормы равны текущему прогнозу FRET за вычетом нормы, полученной раз в два месяца. Следовательно, положительное (отрицательное) отклонение от нормы указывает на FRET выше (ниже) среднего. Более подробная информация об эвапотранспирации и FRET Информация для FRET из этого офиса Национальной метеорологической службы: Справочный прогноз эвапотранспирации (FRET) для короткого полога (или травы 12 см).Значения ET для короткого навеса рассчитываются с использованием эталонных уравнений испарения Пенмана-Монтейта, принятых Институтом экологических водных ресурсов — Американского общества инженеров-строителей (ASCE-EWRI, 2004), и прогноза температуры, относительной влажности и ветра Национальной метеорологической службы. , и облачный покров. Этот продукт будет выходить ежедневно до 8 часов утра по местному времени круглый год. Семинар по микроскопии FLIM и FRET, Университет Вирджинии (март 2020 г.) | The Microscopy AllianceОсобенности курса; практический инструктаж и обучение работе с широкопольными, конфокальными, спектральными и долговечными (FLIM) системами визуализации FRET, обсуждение лучших решений FLIM и FRET для визуализации и анализа данных, персональное внимание максимум для 25 участников с признанным во всем мире факультет. Цели и планы семинара:
Расположение: Университет Вирджинии, Шарлоттсвилль, Вирджиния Контактное лицо: Dr.Аммаси Периасами, директор центра Центра клеточной визуализации им. В.М. Кека, профессор биологии и биомедицины. Eng., Университет Вирджинии, телефон: (434) 243-7602 или 982-4869, электронная почта: [email protected] Финансовая поддержка: Гистохимическое общество поддерживает ДВЕ стипендии (каждая по 1000 долларов США) для участия в семинаре, который вы можете использовать его для оплаты обучения в мастерской. Посетите веб-сайт премии 2019 года, щелкнув эту ссылку — http://histochemicalsociety.org/Awards/Awards.aspx. Также доступна ограниченная финансовая помощь.Смешанная спектральная визуализация и FRET-микроскопияПроблемы, связанные с шириной спектральной полосы и размером, с которыми встречаются флуоресцентные белки, также связаны с их высоким сродством к олигомеризации. Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria и его производных димеризоваться при иммобилизации в высоких концентрациях (например, при ограничении плазматическая мембрана).Этот артефакт также наблюдался в мотиве строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных в рифовых кораллах и морских анемонах. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место. После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы.Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природных олигомеров (таких как актин, тубулин и щелевые соединения; см. Рисунок 4). Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria), могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание, при условии, что локальная концентрация остается низкой. Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, как описано выше, локальная концентрация белка может стать достаточно высокой, чтобы позволить димеризацию. |