Лада 4 фото: Фото Lada 4×4 — фотографии, фото салона Lada 4×4, I поколение

Содержание

фото лада 4

..


Ранее сообщалось, что производство пятидверной Lada 4×4 будет прекращено до конца 2015 года, и такие слухи до сих пор ходят в интернете (связаны они в ...


Фото лада 4


Фото лада 4


... гордости председателя правления компании из Тольятти Бу Андерссона (Bo Andersson) стал тот факт, что ещё семь недель назад проекта LADA4×4 даже не было ...


... lada-signet-wagon-05.jpg ...


задняя часть Lada 4x4 Нива Urban 2015


Редакции Probeg.com стали известны цены на обновленные Lada 4×4 (Нива-2014). Автомобили поступят в автосалоны уже в ближайшие дни.


Специальный бронированный автомобиль на базе LADA 4×4 (ВАЗ-21310 «Нива») представляет собой компактный городской автомобиль, также пригодный для ...


Lada 4x4 u2013 Urban цены и комплектации нового городского «джипа»


Фото Лада 4×4 Urban 2014 u2014 2015 модельного года


www. drive.ru


АВТОВАЗ приступил к продажам новой спецверсии популярного внедорожника Lada 4×4 Elbrus Edition.


... Эксклюзивные фото LADA 4x4 Urban


Жигули 4 фото


Стоит отметить, что производством новой версии LADA 4×4 Urban занимается другая дочерняя компания ОАО «ПСА ВИС-АВТО». «Городские Нивы» собираются в рамках ...


Через полтора года Ладе 4×4 стукнет сорок лет. В прошлом году наш первый неармейский вседорожник обзавелся модификацией Урбан. Выясняем, как старожил рынка ...


38-й день рождения Lada 4×4


АвтоВАЗ продолжит выпускать модель Lada 4×4 до 2021 года, однако за это время автомобиль претерпит целый ряд изменений.


WAZ 2106 Lada ...


Отечественный автогигант намеревается обновить классическую народную «Ниву», имеющую официальное название Lada 4×4. Известно, что в будущем у внедорожника .


Создано: 2016-03-06
Читателей: 58

Подобные фотографии:

Влад Бумага (Влад A4) – биография, фото, личная жизнь, рост и вес, слушать песни онлайн 2021

Биография Влада Бумаги

Влад Бумага – популярный видеоблогер из Беларуси, обладатель бриллиантовой кнопки YouTube (выдается за 10 млн подписчиков на канале) и огромной армии подписчиков, численность которой недавно достигла пятнадцати миллионов человек.
Такого фантастического успеха молодой блогер сумел добиться всего за неполных три года и порой сам не может поверить в столь ошеломляющий результат. При этом он продолжает оставаться милым хорошо воспитанным парнем, который принципиально не употребляет в своих роликах матерные слова и является категорическим противником алкоголя и наркотиков.

На фото: Влад Бумага

Детство и семья

Влад родился 5 июня 1996 года в Минске, в семье инженера-конструктора и учительницы младших классов. Бумага – это его настоящая фамилия, которой он довольно долго стеснялся. В раннем детстве мальчик даже просил родителей сменить нелепую, по его мнению, фамилию на более благозвучную. Со временем у повзрослевшего юноши появились другие интересы, и он перестал комплексовать по этому поводу.

Влад Бумага в детстве

В подростковом возрасте Влад, как и многие его сверстники, увлекался музыкой и брейк-дансом. Параллельно занимался хоккеем, с семи лет посещал детскую спортивную школу «Юность», а затем стал нападающим юношеского резерва минского «Динамо».

Влад Бумага и его младший брат

Парень подавал большие надежды, регулярно ездил с командой на сборы и соревнования, год провел на тренировочной базе в Чехии. Полученная в шестнадцать лет травма поставила крест на его спортивной карьере, и Влад обратил свой взор в сторону YouTube.

Первые шаги к успеху

Будучи активным и любознательным парнишкой, он не мог не заинтересоваться видеоконтентом, который к этому времени предлагали его ровесники-блогеры. Немного вникнув в суть происходящего на YouTube, Владу тоже захотелось сделать нечто подобное, и он зарегистрировал в видеохостинге свой собственный канал.

Влад Бумага – популярный видеоблогер из Беларуси

В качестве никнейма он взял псевдоним А4, которым обозначается самый популярный бумажный формат. Юноша интуитивно почувствовал, что эта аббревиатура принесет ему удачу, и в честь первого миллионного подписчика набил татуировку с ее изображением на внутренней стороне ладони.

Влад Бумага взял себе псевдоним А4

В своем первом видео, опубликованном в декабре 2014 года, новоиспеченный блогер показал фокус с деньгами, который подсмотрел здесь же, на YouTube. Первый блин вышел комом, и Влад стал искать новые источники для вдохновения. Несколько следующих роликов были посвящены хитовым видеоиграм и другим популярным в молодежной среде темам (например, отношениям парней с девушками, школьным приколам и случаям из жизни).

Очень удачным получился сюжет «Когда мамы нет дома», при этом Влад не забывал поддерживать с подписчиками обратную связь и таким образом мониторил их вкусы и интересы.

Влад Бумага в юности

Со временем он открыл для себя необходимые алгоритмы, которые помогают продвигать ролики на YouTube (описание, название и т.д.). Юноша просмотрел множество видеокурсов на интересующие его темы, обзавелся профессиональной камерой и стал активно развиваться в выбранном направлении.

Блогер-миллионник

Первый ощутимый успех и резкий всплеск зрительского интереса Владу принесли различные челленджи (вызовы) и лайфхаки, которые он находил в просторах интернета или придумывал сам. Среди них самыми популярными стали ночи, проведенные в закрытых для посетителей аквапарке, батутной арене, на ледовом катке и футбольном стадионе.

Влад Бумага - обладатель бриллиантовой кнопки YouTube

Параллельно Влад пробовал записывать музыкальные клипы и пародии на известных исполнителей. Рекордное количество просмотров собрала пародия «Тает срок» на популярную в то время группу «Грибы» и их суперхит «Тает лед». Блогер не скрывал, что использовал эту тему, чтобы попасть в тренды, и его расчет оказался верным. А4 - Тает Срок (Пародия на Грибы - Тает Лёд) С того момента количество его подписчиков стало расти как на дрожжах, и к февралю 2020 года достигло 15 миллионов человек. В своих интервью Влад не раз подчеркивал, что это больше, чем все население Беларуси, численность которого по результатам последней на то время переписи составляла девять с половиной миллионов человек.

Секрет своего успеха видеоблогер видит в разнообразном контенте, лишенном какой-либо конкретной тематики. Количеству публикуемого материала он предпочитает качество, принципиально не употребляет матерных слов и категорически не приемлет пропаганды насилия, алкоголя и наркотиков.

Ему важно не опозориться перед своими родными и близкими, а также служить положительным примером младшему брату Глебу, который в 2019 году пошел в первый класс. Влад даже посвятил малышу ролик «24 часа говорю „Да“ младшему брату», в котором за весь день не отказал ни в одной его просьбе. Влад Бумага - «24 часа говорю „Да“ младшему брату»

Личная жизнь Влада Бумаги

С 2017 года Влад находится в романтических отношениях с Юлией Годуновой – популярным белорусским видеоблогером, а с недавних пор еще и певицей. Они заочно познакомились благодаря YouTube, несколько месяцев следили за творчеством друг друга, пока не встретились в общей компании.

Влад Бумага с Юлией Годуновой

В один из теплых мартовских дней 2017 года ребята решили провести время в квест-клубе. Испытания оказались такими сложными и страшными, что Юле невольно приходилось прижиматься к Владу, дабы побороть свой страх. С тех пор они практически неразлучны, вместе делают ремонт в недавно купленной квартире в центре Минска, много путешествуют и не устают радовать поклонников своими новыми видеороликами на YouTube.

Влад Бумага сейчас

На сегодняшний день Влад является самым популярным видеоблогером Беларуси и одним из самых успешных в России. В 2021 году количество подписчиков на канале Влада А4 достигло 27 миллионов – Бумага является обладателем бриллиантовой кнопки YouTube.

В 2020 году А4 выпустил мерч – футболку с собственным логотипом он продемонстрировал в эфире Первого канала, явившись в ней на шоу «Вечерний Ургант». В передаче блогер поделился секретами своего фантастического успеха и сыграл с ведущими в игру «Откуси, лизни или ничего», популярную на просторах интернета.

Влад Бумага на шоу «Вечерний Ургант» Также огромный интерес вызвало появление Влада в популярном интернет-шоу «Comment Out», где ему компанию составил рэпер Егор Крид. За неполные сутки выпуск посмотрели более двух миллионов человек, что стало абсолютным рекордом для этого шоу.

Влад Бумага в 2020 году

В январе 2021, сразу после Нового года Влад отправился в отпуск на Мальдивы, откуда опубликовал несколько ярких фотографий.

Редакция УзнайВсё.ру

Обнаружив ошибку в тексте, выделите ее и нажмите Ctrl+Enter

Влад Бумага - слушать онлайн

ОТЕЛЬ ЛАДА-РЕЗОРТ 4* (Тольятти) - отзывы, фото и сравнение цен

Часто задаваемые вопросы об отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ

Какие популярные достопримечательности находятся недалеко от отеля Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Ближайшие достопримечательности: Памятник В. Н. Татищеву (2,0 км), Спасо-Преображенский собор (7,2 км) и Тольяттинский краеведческий музей (7,4 км).

Какие удобства и услуги доступны в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Самые популярные предлагаемые удобства и услуги: крытый бассейн, бесплатный Wi-Fi и бесплатный завтрак.

Какие удобства и услуги в номерах доступны в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Лучшие удобства и услуги в номерах: мини-бар, кондиционер и ТВ с плоским экраном.

Какая еда и напитки доступны в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Во время пребывания у гостей есть возможность воспользоваться следующими услугами питания: бесплатный завтрак и ресторан.

Доступна ли парковка в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Да, гостям предоставляется доступ к услугам парковки бесплатная парковка, охраняемая парковка и парковка на улице.

Какие рестораны расположены недалеко от отеля Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Поблизости находятся следующие рестораны: 20 Франков, Union Bar и Ведро гвоздей.

Есть ли в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ возможность заниматься спортом?

Да, во время пребывания гостям предоставляется доступ к следующим фитнес-услугам: крытый бассейн, фитнес-центр и сауна.

Предлагает ли отель Отель ЛАДА-РЕЗОРТ трансфер от/до аэропорта?

Да, отель Отель ЛАДА-РЕЗОРТ предлагает гостям трансфер от/до аэропорта. Мы рекомендуем позвонить заранее и уточнить все подробности.

Предоставляются ли в отеле Отель ЛАДА-РЕЗОРТ услуги уборки?

Да, гостям предоставляется доступ к услугам уборки химчистка и прачечная.

Предлагает ли отель Отель ЛАДА-РЕЗОРТ какие-либо бизнес-услуги?

Да, в отеле предлагаются бизнес-услуги бизнес-центр, конференц-залы и банкетный зал.

На каких языках говорит персонал отеля Отель ЛАДА-РЕЗОРТ?

Персонал говорит на нескольких языках, включая английский, французский, немецкий и русский.

Нужна дополнительная информации?

СМИ опубликовали фото обновленной Lada 4x4

https://ria.ru/20191126/1561588769.html

СМИ опубликовали фото обновленной Lada 4x4

СМИ опубликовали фото обновленной Lada 4x4 - РИА Новости, 03.03.2020

СМИ опубликовали фото обновленной Lada 4x4

"Российская газета" опубликовала снимки серийного экземпляра рестайлингового внедорожника Lada 4x4. РИА Новости, 03.03.2020

2019-11-26T02:45

2019-11-26T02:45

2020-03-03T17:44

россия

авто

автоваз

lada

/html/head/meta[@name='og:title']/@content

/html/head/meta[@name='og:description']/@content

https://cdn25.img.ria.ru/images/156158/88/1561588801_0:160:3072:1888_1920x0_80_0_0_29a575e4d40e37d6ad2517bddf88437b.jpg

МОСКВА, 26 ноя — РИА Новости. "Российская газета" опубликовала снимки серийного экземпляра рестайлингового внедорожника Lada 4x4. Судя по фото, снаружи внедорожник подвергся минимальным изменениям: модель получила новый передний бампер с интегрированными противотуманными фарами. Главной отличительной особенностью обновленной Lada 4x4, как отмечает издание, стал интерьер автомобиля.Так, в салоне внедорожника можно увидеть новую переднюю панель с современной климатической установкой с шайбами вместо прежних ползунков и увеличенными дефлекторами вентиляции.Кроме того, автомобиль получил новую комбинацию приборов, схожую с обновленной Lada Granta FL, доработанный отопитель, новые сиденья с подголовниками заднего дивана, формованный потолок с плафоном и систему ЭРА-ГЛОНАСС.По технической части, как указывает РГ, изменений нет — автомобиль оснащается 1,7-литровым бензиновым двигателем мощностью в 83 лошадиные силы и пятиступенчатой механической коробкой передач.

https://ria.ru/20191125/1561558774.html

россия

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og. xn--p1ai/awards/

2019

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdn21.img.ria.ru/images/156158/88/1561588801_171:0:2902:2048_1920x0_80_0_0_aaec3ce0d5fc8c6323619ec602bdf2dd.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

россия, авто, автоваз, lada

МОСКВА, 26 ноя — РИА Новости. "Российская газета" опубликовала снимки серийного экземпляра рестайлингового внедорожника Lada 4x4.

Судя по фото, снаружи внедорожник подвергся минимальным изменениям: модель получила новый передний бампер с интегрированными противотуманными фарами. Главной отличительной особенностью обновленной Lada 4x4, как отмечает издание, стал интерьер автомобиля.

Так, в салоне внедорожника можно увидеть новую переднюю панель с современной климатической установкой с шайбами вместо прежних ползунков и увеличенными дефлекторами вентиляции.

Кроме того, автомобиль получил новую комбинацию приборов, схожую с обновленной Lada Granta FL, доработанный отопитель, новые сиденья с подголовниками заднего дивана, формованный потолок с плафоном и систему ЭРА-ГЛОНАСС.

По технической части, как указывает РГ, изменений нет — автомобиль оснащается 1,7-литровым бензиновым двигателем мощностью в 83 лошадиные силы и пятиступенчатой механической коробкой передач.

25 ноября 2019, 13:47

АвтоВАЗ запустил продажи обновленного семейства Lada Vesta

Фотогалерея Lada 2104: Фото #04 из 12, размер изображения

Toyota Avanza

В продажу автомашина Тойота Аванза от японского производителя Toyota Motor corporation поступила в 2003 году. Продаётся она и по сей день.

Aston Martin Vanquish

Рады представить Вам чудесный английский суперкар Aston Martin Vanquish, имеющий, безусловно, очень благородную родословную. Только в 2012 году состоялось второе представление модели на рынке.

Pontiac 6000

Автомобиль модели Pontiac 6000 является классическим седаном средних размеров, который компания-производитель General Motors впервые презентовала публике в 1981 году. Серийное производство этой модели стартовало годом позже.

AC Ace

АС Асе – это автомобили британской компании AC Cars, которые начали свою историю в 1951 году, именно тогда увидела свет первая модель данного родстера. Через четыре года модель обновилась и просуществовала до 1962 года.

BMW X5 E53

Первые BMW X5 начали выпускать с 1999 года с одинаковым видом кузова – универсал. Он становится первым в своем роде.

Автомобиль Lada Samara: Фото #04 из 15, размер изображения

Fiat Cinquecento

Версию Fiat Cinquecento выпускали с 1991 по 1998 годы в Польше, а не в Италии как модификацию Fiat Coupe. Fiat Cinquecento представляет собой модель компактного пятиместного городского автомобиля с тремя дверьми.

Suzuki MR Wagon

Японский легковой автомобиль Suzuki MR Wagon причисляемый к классу А, был пущен в массовое производство примерно в декабре 2001 года. Обратим ваше внимание на тот факт, что дебютировал этот компактный автомобиль, мощность которого составляет 54 лошадиные силы, на японском автосалоне в январе 2011 году.

ГАЗ 69

Модель ГАЗ 69 в народе прозвали Козел. Машина позиционируется как легковая, но с повышенной проходимостью.

Audi S4 B7

Ярким представителем третьего поколения концерна Ауди является модель Audi S4 B7. Автомобиль увидел свет в конце 2004-го года.

Daewoo Matiz Creative

Автомобиль является субкомпактным седаном и пользуется огромной популярностью на рынке Южной Кореи. Модель была разработана на основе модели Beat.

ВАЗ 2114 фото - 4 изображений высокого качества

  1. Фотогалерея
  2. ВАЗ
  3. 2114

Фотогалерея ВАЗ 2114 насчитывает 4 фото высокого качества. Последнее обновление в галерее: 09 июн. 2009

399кб. 1024 x 768

32

Фотогалерея ВАЗ 2114

395кб. 1024 x 768

29

399кб. 1024 x 768

32

420кб. 1024 x 768

18

393кб. 1024 x 768

29

Если у вас есть интересные фото ВАЗ 2114, вы можете разместить их в фотофоруме.

Amazon.com: Персонализированный фотоальбом - нейтральный фон с розовыми буквами лада: Handmade



Настраиваемый

Настроить сейчас Настроить сейчас

Что-то пошло не так.Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Что-то пошло не так. Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Покажите свои драгоценные фотографии в этом красивом персонализированном фотоальбоме. Общие размеры этого фотоальбома: 13 1/2 дюймов Д x 8 1/2 дюймов Ш x 2 1/4 дюйма В. Каждый альбом вмещает 204 фотографии размером 4 x 6 дюймов. Альбом выполнен в стиле с тремя кольцами и может вместить дополнительные страницы пополнения (продаются отдельно).Прозрачные карманы предназначены для боковой загрузки и фотобезопасности: без выбросов кислоты и полипропилена. ** Дополнительные элементы на фото в продажу не входят. Это объявление только для одного фотоальбома.

h3.default { цвет: # CC6600; размер шрифта: средний; маржа: 0 0 0,25em; } #productDescription_feature_div> h3.books { цвет: # 333! важно; размер шрифта: 21px! важно; высота строки: 1,3; padding-bottom: 4px; шрифт: нормальный; маржа: 0px; } #productDescription_feature_div> h3.softlines { цвет: # 333! важно; размер шрифта: 21px! важно; высота строки: 1.3; padding-bottom: 4px; font-weight: жирный; маржа: 0px; } #productDescription> p, #productDescription> div, #productDescription> table { маржа: 0 0 1em 0; } #productDescription p { маржа: 0em 0 1em 1em; } #productDescription h4 { шрифт: нормальный; цвет: # 333333; размер шрифта: 1. 23em; ясно: слева; маржа: 0.75em 0px 0.375em -15px; } #productDescription table { граница-коллапс: наследование! важно; нижнее поле: 0; } #productDescription table img { максимальная ширина: наследовать! важно; } #productDescription table td { размер шрифта: маленький; вертикальное выравнивание: наследовать! важно; } #productDescription ul li { маржа: 0 0 0 20 пикселей; } #productDescription ul li ul { тип-стиль списка: disc! important; маржа слева: 20 пикселей! важно; } #productDescription ul ul li { тип-стиль списка: disc! important; маржа слева: 20 пикселей! важно; } #productDescription> ul ul li { тип-стиль списка: disc! important; } #productDescription ul li ul li { маржа: 0 0 0 20 пикселей; } #описание продукта .aplus p { маржа: 0 0 1em 0; } #productDescription small { размер шрифта: меньше; } # productDescription.prodDescWidth { максимальная ширина: 1000 пикселей } ]]>

Сэкономьте 10 долларов в Prime Day, потратив 10 долларов на малый бизнес сегодня

9 основных гитарных аккордов, которые нужно знать начинающим! С фотографиями в помощь - Musicians HQ

Итак, вы хотите играть на гитаре. Потрясающие! Если вы запутались или не знаете, с чего начать, вы попали в нужную статью. Это простое руководство покажет вам гитарных аккордов с иллюстрациями, и гитарных аккордов с изображениями рук.

Я не могу обещать, что эти аккорды поначалу будут легкими, но они необходимы. Эти аккорды являются строительными блоками музыки, и знание их позволит вам исполнять широкий спектр популярных песен! Просмотрите список из 20 гитарных песен для начинающих до конца статьи.

Эти аккорды предназначены для начинающих, потому что это открытые аккорды, то есть есть струны, которые вы играете открытыми. Другое озвучивание этих аккордов требует запрета и более сложных положений пальцев. Эти 9 простых гитарных аккордов имеют простые формы, которые не сложно освоить.

Давайте разберемся с этими 9 основными гитарными аккордами для начинающих.

Как читать таблицу гитарных аккордов


Как вы можете видеть на изображении выше, мы иллюстрируем гитарный аккорд с помощью таблицы аккордов. Прежде чем выучить какие-либо аккорды, вам нужно научиться читать таблицу. Это довольно просто:

  • Вертикальные линии представляют струны гитары, как если бы вы смотрели на гриф прямо и прямо. Струна в крайнем левом углу - это нижняя E, а струна в крайнем правом углу - это высокая E. (Между ними находятся струны A, D, G и B).
  • Горизонтальные линии представляют маркеры ладов. Пространство между каждой горизонтальной линией - лад.
  • Более толстый черный блок в верхней части диаграммы представляет гайку гитары.
  • Черные кружки показывают, куда вы кладете пальцы. (Ваши пальцы всегда проходят между маркерами ладов, а не поверх них)
  • Кружки и крестики в верхней части таблицы показывают, играете ли вы на струне или нет. Круг означает, что вы играете на открытой струне (не трогаете эту струну), а X означает, что вы вообще не играете на струне.
  • Буквы внизу таблицы, выровненные по строкам, иногда говорят вам, на какой высоте вы играете. Это очень полезно для изучения того, какие ноты составляют триаду!

Самые популярные

Давайте разберем эти важные аккорды на части, чтобы сделать их более удобоваримыми.

Если вы только начинаете изучать гитару, эти четыре аккорда - до мажор, ля минор, фа мажор и соль мажор - позволят вам сыграть сотен , если не тысяч песен, многие из которых вы, вероятно, уже знаете. !

  • До мажор - аккорд до мажор состоит из нот до, ми и G.

Вот как играть до мажор на гитаре:

  • ля минор - аккорд ля минор состоит из нот A, C и E.

Вот как играть на гитаре ля минор:

  • Фа мажор - аккорд фа мажор состоит из нот F, A и C.

Вот как играть фа мажор на гитаре:

Краткое примечание об аккорде фа мажор, аккорд фа мажор - сложный аккорд, который бросал вызов гитаристам с незапамятных времен . .. Если у вас возникнут проблемы, попробуйте другое озвучивание, ознакомившись с этой статьей, 8 способов сыграть фа-аккорд Feared на гитаре.(Эта форма, вероятно, самая простая, если вы начинающий гитарист, поскольку она не требует запретов.)

  • G Major - аккорд G Major состоит из нот G, B и D.

Вот как играть G Major на гитаре:

Эти четыре аккорда представляют последовательность аккордов I-vi-IV-V в тональности C. С помощью этих четырех аккордов вы можете сыграть множество популярных песен.

Другие общие аккорды, которые вам понадобятся

Убрав эти четыре аккорда, вот еще 5 гитарных аккордов, которые вы часто встретите в песнях.

  • Ре мажор - Аккорд ре мажор состоит из нот D, F # и A.
  • Ре минор - Аккорд ре минор состоит из нот D, F и A.
  • E Major - Аккорд E Major состоит из нот E, G # и B.
  • ми минор - аккорд ми минор состоит из нот E, G и B.
  • A Major - Аккорд A Major состоит из нот A, C # и E.

Теперь вы можете играть в эти песни!

Уберите все эти гитарные аккорды, и вы сможете сыграть все эти песни! И если вы хотите испытать себя, я пометил некоторые, которые включают другие аккорды / вариации, не описанные в этой статье.

Если сейчас это кажется непосильным, не волнуйтесь! Это нужно запоминать, практиковать и совершенствовать. Если вы чувствуете себя подавленным, начните с аккордов C, Am, F и G. Эти четыре откроют вам больше всего возможностей начать играть на гитаре.

Хорошо, что музыка дает нам отправную точку, а еще лучше то, что так много запоминающихся песен следуют одному образцу. Просто продолжайте придерживаться этого, и вы сможете сыграть несколько хитов на следующей вечеринке!

Определение эффективности FRET в системах визуализации с помощью фотообесцвечивающих акцепторов

. 15 июля 2010 г .; 82 (2): 771-4. DOI: 10.1016 / j.talanta.2010.05.051. Epub 2010 1 июня.

Принадлежности Расширять

Принадлежность

  • 1 Ключевая лаборатория атомных и молекулярных нанонаук Министерства образования, Департамент физики, Университет Цинхуа, Пекин, Китай.

Элемент в буфере обмена

Chuyun Deng et al. Таланта. .

Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

.15 июля 2010 г .; 82 (2): 771-4. DOI: 10.1016 / j.talanta.2010.05.051. Epub 2010 1 июня.

Принадлежность

  • 1 Ключевая лаборатория атомных и молекулярных нанонаук Министерства образования, Департамент физики, Университет Цинхуа, Пекин, Китай.

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Опции CiteDisplay

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) широко используется для определения расстояния между донором и акцептором в биологических исследованиях.Однако обнаружение эффективности FRET с помощью систем визуализации флуоресцентной микроскопии остается большой проблемой из-за трудностей перевода серых шкал изображений в интенсивности флуоресценции и отсутствия точных квантовых выходов доноров и акцепторов. Здесь мы представили новый метод определения эффективности FRET в системах визуализации путем анализа вызванных фотообесцвечиванием изменений интенсивности флуоресценции квантовых точек (квантовые точки, доноры) и красителей Cy5 (акцепторы). Наш метод отличается от предыдущих исследований акцепторного фотообесцвечивания в системах визуализации тем, что теоретически анализирует процесс отбеливания и предлагает новый параметр, который является универсальным для образцов того же типа.Это удобно для расчета эффективности FRET. Между 605QD и Cy5 практически нет спектральных перекрестных помех, поэтому результат FRET более точен, чем у многих других распространенных пар FRET. Длины одноцепочечных и двухцепочечных фрагментов ДНК в растворе определяли с помощью анализа значений эффективности FRET. Этот метод обеспечивает надежный подход к изучению биомакромолекул в живых клетках с помощью флуоресцентной визуализации и измерений in situ.

Авторские права 2010 Elsevier B.V. Все права защищены.

Похожие статьи

  • Флуоресцентный резонансный перенос энергии между донорами квантовых точек и акцепторами белков, меченных красителем.

    Клапп А.Р., Мединц Иллинойс, Мауро Дж.М., Фишер Б.Р., Бавенди М.Г., Маттусси Х. Клапп А.Р. и др. J Am Chem Soc. 2004, 14 января; 126 (1): 301-10. DOI: 10.1021 / ja037088b. J Am Chem Soc. 2004 г. PMID: 14709096

  • Могут ли люминесцентные квантовые точки быть эффективными акцепторами энергии с донорами органических красителей?

    Клапп А.Р., Мединц Иллинойс, Фишер Б.Р., Андерсон Г.П., Маттусси Х.Клапп А.Р. и др. J Am Chem Soc. 2005 2 февраля; 127 (4): 1242-50. DOI: 10.1021 / ja045676z. J Am Chem Soc. 2005 г. PMID: 15669863

  • Исследования резонансного переноса энергии Фёрстера с использованием флуорофоров с квантовыми точками.

    Клапп АР, Мединц Иллинойс, Маттусси Х. Клапп А. Р. и др. Chemphyschem. 2006 16 января; 7 (1): 47-57. DOI: 10.1002 / cphc.200500217. Chemphyschem.2006 г. PMID: 16370019 Рассмотрение.

  • Резонансный перенос энергии флуоресценции флуоресценции в фазе раствора.

    Понс Т., Мединц Иллинойс, Ван Х, английский Д.С., Маттусси Х. Понс Т. и др. J Am Chem Soc. 2006 29 ноября; 128 (47): 15324-31. DOI: 10.1021 / ja0657253. J Am Chem Soc. 2006 г. PMID: 17117885

  • Визуализация белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентной резонансной микроскопии с переносом энергии.

    Kenworthy AK. Kenworthy AK. Методы. 2001 июл; 24 (3): 289-96. DOI: 10.1006 / meth.2001.1189. Методы. 2001 г. PMID: 11403577 Рассмотрение.

Процитировано

1 артикул
  • Использование люминесцентных нанокластеров золота ближнего инфракрасного диапазона для обнаружения макрофагов.

    Сапожникова В., Уилси Б., Асмис Р., Ван Т., Дженкинс Дж. Т., Манкузо Дж., Ма Л.Л., Куранов Р., Милнер Т.Е., Джонстон К., Фельдман М.Д. Сапожникова В. и др. J Biomed Opt. 2012 Февраль; 17 (2): 026006. DOI: 10.1117 / 1.JBO.17.2.026006. J Biomed Opt. 2012 г. PMID: 22463038 Бесплатная статья PMC.

Типы публикаций

  • Поддержка исследований, Non-U.С. Правительство

Условия MeSH

  • Карбоцианины / химия
  • Флуоресцентный резонансный перенос энергии / методы
  • Флуоресцентные красители / химия
[Икс]

цитировать

Копировать

Формат: AMA APA ГНД NLM

Guitar Shop 101: Как пропилить острые лады

Я всегда могу сказать, когда у нас была холодная зима, по гитарам, которые приходят в мой магазин. Когда люди включают тепло в холодную погоду, из воздуха удаляется влага. Гриф гитары может сжиматься в среде с низкой влажностью, в результате чего концы ладов немного выступают с обеих сторон грифа. Как правило, вы можете предотвратить это, используя увлажнитель воздуха в помещении или недорогое устройство для увлажнения гитары, но, как только острые концы ладов выступают наружу, вам нужно с ними справиться, потому что они делают игру на гитаре очень неудобной. Отремонтировать острые лады несложно, но для этого нужны подходящие инструменты и материалы, и вы должны знать, что делаете.

На фото 1 показан пример резких ладов. Это довольно новая гитара, но владелец, очевидно, никогда ее не увлажнял. На этом этапе концы ладов нужно подпилить, придать им форму и отполировать.


Фото 2

Для этой работы вам понадобятся два напильника: плоский напильник с мелкими зубьями (, фото 2, ) и трехугловой миниатюрный напильник (, фото 3, ), специально предназначенный для работы с резьбой.


Фото 3

Плоские напильники с мелкими зубьями бывают разных размеров и форм, их можно приобрести в специализированных компаниях по производству гитарных инструментов, таких как Stewart-MacDonald, Luthiers Mercantile и Allparts, а также в магазинах товаров для дома.Ищите пилку с мелкими зубьями длиной от 3 1/2 до 8 дюймов. Некоторые компании продают напильники с алмазным покрытием, и они тоже хорошо работают.

Я предпочитаю трехугольные миниатюрные напильники Nicholson, но большинство брендов справляются со своей задачей. Напильник с тремя углами идеально подходит для закругления сторон лада, и лучший тип для этой работы - напильник с одинарной резкой. Другими словами, зубья пилки режут только в одном направлении, что ограничивает скопление мусора.

Важно: Убедитесь, что вы скруглили и отшлифовали один из углов файла. В противном случае напильник может врезаться в гриф (и переплет, если он есть на гитаре). Я использовал ленточную шлифовальную машину, чтобы аккуратно удалить зубы с одного из краев файла. Если вы не хотите делать это самостоятельно, упомянутые выше поставщики гитарных инструментов продают трехугловые напильники со сглаженными передними кромками, предназначенные для лепки.


Фото 4

Филе ладов концы. Первый шаг - подпилить выступающие концы ладов заподлицо с грифом. Прижмите плоскую пилку с мелкими зубьями к боковой поверхности грифа и осторожно перетащите пилку от первого лада вниз до последнего лада ( Фото 4 ).Позвольте инструменту делать свою работу - вы просто им управляете. Если вы нажмете слишком сильно, вы можете порезаться на грифе или переплете.

После того, как лады будут подшиты заподлицо с грифом, слегка наклоните плоский напильник - примерно от 35 до 45 градусов - и скользите по концам ладов, пока они не получат равномерный скос. Но убедитесь, что вы не добавили слишком много фаски. Если скос слишком длинный, струны E могут соскользнуть с ладов при игре.

Отремонтировать острые лады несложно, но для этого нужны подходящие инструменты и материалы, и вы должны знать, что делаете.

Когда концы ладов с обеих сторон грифа выглядят одинаково и гладко, вы готовы к следующему шагу.

Закругление кончиков ладов. Эта операция требует терпения и навыков. Цель состоит в том, чтобы сгладить края ладов там, где они встречаются с грифом, чтобы лады не казались острыми. Используя специальную трехугловую пилку, поместите «беззубый» край вниз, в сторону грифа, и аккуратно перекатите пилку по краю ладового конца ( Фото 5, ).Чтобы сгладить лад, достаточно трех или четырех мягких движений.

Повторите этот процесс для каждой стороны каждого лада, пока все лады не станут гладкими и округлыми. Всегда следите за файлом, особенно когда работаете над телом. Вы же не хотите срезать или выдолбить этот верх! Пилить медленно и методично. Если вы хотите защитить гитару, вы можете использовать малярный скотч с низкой липкостью, чтобы замаскировать уязвимые места.


Фото 5

Удаление следов инструмента. Пришло время навести порядок. Используя однолезвийную бритву, осторожно потрите гриф взад и вперед, пока все следы инструмента не исчезнут (, фото 6, ). Легкими прикосновениями не соскребайте слишком много дерева. Цель состоит в том, чтобы удалить минимальное количество материала, необходимого для сглаживания следов.

Полировка кончиков ладов. Следующий шаг - использовать сверхтонкую полировальную бумагу, которая доступна во многих стилях (включая салфетки с микрочастицами и «ластики» для ладов в последовательной серии зерен) от поставщиков ювелирных изделий и компаний, производящих аксессуары для гитар, таких как Dunlop и Planet Waves. .

Возьмитесь за полировочную бумагу или ткань и осторожно потрите концы ладов вдоль грифа. Это придает ладам красивый блестящий вид. Пока вы занимаетесь этим, почему бы не отполировать вершины всех ладов?


Фото 6

Кондиционирование грифа. Последний шаг в нашем процессе - кондиционирование грифа. Существуют десятки средств для чистки и кондиционирования открытых необработанных деревянных досок гитары. Путем небольшого исследования и некоторых проб и ошибок вы найдете продукт, который вам подходит.

Нанесите кондиционер на гриф и потрите его старой зубной щеткой. Это удалит скопившуюся грязь и пот, а также поможет древесине впитать кондиционер. Когда гриф полностью покрыт, вытрите его бумажным полотенцем.

Прощальные мысли. Как мы видели, основной причиной острых концов ладов является недостаток влажности. Оптимальный уровень влажности для любой гитары составляет 40-50 процентов. Кондиционирование грифа помогает свести к минимуму проблемы с влажностью, но все же крайне важно, чтобы ваша гитара оставалась влажной.Итог: стоит попробовать различные увлажнители для гитары. Разработанные, чтобы поместиться в корпус или футляр гитары, они недороги и просты в использовании. Увлажнители могут предотвратить появление острых кончиков ладов и сэкономить массу работы.

Основы FRET-микроскопии | Nikon's MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов.В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов. Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом исследования взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале. Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Рисунок 1 - Фёрстеровский резонансный перенос энергии Яблонски Диаграмма

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.Используя этот метод, молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем - вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов. Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же соседстве, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Флуоресцентная визуализация с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает из-за относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применяя методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 - это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на , рис. 1, ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привели к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (одиночный генетически кодируемый конструкт), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за различной стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F люоресценция C комплементация; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция под названием cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов в начало седьмой beta -цепи в остове флуоресцентного белка. Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных концов N и C и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками , могут быть объединены с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

Рисунок 2 - Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения протеазной активности

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на изменениях протонирования нативного (дикого типа) GFP, которые приводят к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в реальном времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. Рисунок 2 ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать датчик во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, - это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Рисунок 3 - Переменные Фёрстера расстояние и коэффициент ориентации в FRET

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и уменьшении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

Формула 1 - Эффективность FRET

E FRET = 1 / [1 + (r / R 0 ) 6 ]

, где R (0) - характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно рассчитать для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Фёрстера и обсуждается ниже более подробно).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний меньше R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний больше R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на рис. 3 (а) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET можно эффективно использовать в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только между с высоким FRET, и с низким FRET, или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или забуференном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:

Формула 2 - R (0)

R 0 = [2,8 x 10 17 × Κ 2 × Q D × Ε A × J (λ)] 1/6 нанометров

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя диполями флуорофора (см. Рисунок 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) - квантовый выход донора, Ε (A) - максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) - интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, - это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает на то, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами примерно так же, как положение радиоантенны может влиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень совмещения определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может изменяться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Почти для любой реалистичной ситуации Κ (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы изменить это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам). Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Рисунок 4 - Интеграл перекрытия спектра возбуждения и излучения

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, которые возникают из-за изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как в другом канале преобладает систематический шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема - измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET. Из-за того, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по межбелковому взаимодействию, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия является фиксированной и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозного прохождения (также называемое перекрестными помехами и перекрестным перекрестным возбуждением ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. Рисунок 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора (, рис. 5 (а), ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора значительно перекрываются (, рис. 5 (b), ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, которые хорошо разделены спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имеют значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Ферстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждая из описанных выше проблем может быть смягчена (или частично) осознанным выбором пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Рисунок 5 - Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRET

Представлено в Рис. 5 - это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET. Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, рис. 5 (а), ), так и излучения (, рис. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (a) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP (, рис. 5 (b), ) демонстрирует значительное перекрытие по интенсивности во всем диапазоне излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, поскольку каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, возникающих в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

  • Сенсибилизированная эмиссия - Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
  • Фотообесцвечивание акцептора - Этот метод, также известный как расщепление донора , измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
  • Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) - Измерение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
  • Спектральная визуализация - Возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
  • Флуоресцентная поляризационная визуализация - Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация - самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Сенсибилизированное излучение

Также обычно называемый двухцветной визуализацией с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для получения изображений с сенсибилизированным эмиссионным FRET разработано множество корректирующих подходов. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Рисунок 6 - Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRET

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированное излучение является особенно привлекательным методом при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, проиллюстрированный на рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля, когда пептидный линкер ферментативно расщепляется. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцепторное фотообесцвечивание

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и что акцептор фотообесцвечивается примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормирования этого значения на интенсивность донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, ограничивая его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание - относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 являются примерами FRET-анализа сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцептора с использованием визуализации живых клеток. Фиг. 6 (a) иллюстрирует эпителиальную клетку карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующую биосенсор Cameleon, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET - желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) в фиг.6 (d) - (f) были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фиг.6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фиг.6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и направленный на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рис. 6 (е) ) увеличивает расщепление донора (увеличение зеленой флуоресценции на рис. 6 (е) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале. Только.

Флуоресцентная микроскопия для непрерывной визуализации (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET - их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

Рисунок 7 - Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET-микроскопии

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в области наносекундного срока службы являются сложными, а оборудование является дорогостоящим в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Более того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра - типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но также различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Для получения спектральных изображений требуется специальное оборудование, но превосходные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Основным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в Рис. 7 (a) представляют собой изменения в уменьшении времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет собой энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль излучения от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на , рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения на 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (приблизительно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивностях на 475 и 529 нанометрах этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Отображение поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом выбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, ​​если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, то излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Рисунок 8 - Получение изображений FRET с поляризационной анизотропией

Основная сила этого подхода - простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал / шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображений, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку это может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET следует ограничивать получением изображений с помощью объективов с числовой апертурой 1,0 или меньше.

Представлено в Рисунок 8 - графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков (, рис. 8 (а), ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( рис. 8 (b) ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( рис. 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансная передача энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для изучения явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. сеточка. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от примерно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке разделить донорную и акцепторную флуоресценцию. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (называемый бета -ствол или бета -кан ) и состоящий из полипептида с обширной водородной связью beta -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. фиг.9, ).Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9, ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Рисунок 9 - Архитектурные особенности флуоресцентного белка

Высокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации.Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных у рифовых кораллов и анемонов. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание, при условии, что локальная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы позволить димеризацию. Это может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут дать сложные наборы данных, которые иногда могут быть скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация в белках , Aequorea , в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Токсичность - это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации.Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным агентом для инактивации определенных белков с помощью хромофорной инактивации света ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако длительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов пригодны для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа в сравнении с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (от примерно 450 до 650 нанометров), тем самым заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. во всех цветовых классах. Недавние успехи в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы по разработке белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. таблицу 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей области спектра и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки могут быть легко визуализированы в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в сочетании с белками, излучающими желтый цвет, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета проявляет более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с CFP Aequorea и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки в голубом спектральном классе. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP, названный CyPet (от аббревиатуры: Cy - флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ), был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Введение полезных мутаций сворачивания и в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные супер CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных меток слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, излучающий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нанометров соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую ​​же яркость, что и Cerulean.

Таблица 1 - Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET930 909 9029 t
Белковая пара Максимум возбуждения донора
(нм)
Максимум излучения акцептора
(нм)
Квантовый выход донора Коэффициент молярной экстинкции акцептора Яркость Фёрстера
EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57,500 4,8 1: 2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83,400 4,9 1: 4 528 0,62 92,200 5,4 1: 2
MiCy-mKO 472 559 0,90 51,600 492528 0.85 92,200 5,1 1: 1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104 000 5,1 1: 4,5610 0.60 72,000 5,1 2,5: 1
Venus-mCherry 528 610 0,57 72,000528581 0.57 138,000 5,9 1: 2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41,000 5,2 1310 9109

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно было создано новое дополнение к зеленой области спектра - суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Произведенный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальным альтернативным партнером FRET, излучающим зеленый цвет, для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нм и излучение при 505 нм. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из самых универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны предоставить кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. , Таблица 1, ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации тегов слияния, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой мономерное производное медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), был также получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом, когда-либо разработанным, и демонстрирует приемлемую фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой при разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще не установлена. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо работает с другими вариантами Aequorea (хотя это, очевидно, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный апельсин кусабира, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем внесения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, подобное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди всех белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

Рисунок 10 - Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором

Проиллюстрировано на , рисунок 10, - спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (красные и синие заштрихованные области соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение в экспериментах, требующих повторной визуализации.Тем не менее, mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый свет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (под названием mOrange2 ) с резко увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный оранжевый белок, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для локализации и исследований FRET и может оказаться эффективным в большом количестве конструкций биосенсоров. Самый яркий флуоресцентный белок в любом спектральном классе - это тандемная версия димерного Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N - и C - с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов при локализации, а также повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Тандемно-димерная версия (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (в два раза больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияния, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красные белки mFruit , mApple , mCherry и mStrawberry (пики эмиссии при 592, 610 и 596 нанометрах соответственно) имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, представляющих первые настоящие дально-красные генно-инженерные зонды. Самый потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией и в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как Изумруд и Цитрин (см. Рисунок 10 ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимумы эмиссии 635 нанометров). Несмотря на то, что яркость Катушки составляет всего две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем 650-800 нанометров, области, которая важна для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к получению мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое возбуждение акцептора. Другой фактор, который может иметь значение, - это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают намного быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скорости созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты с FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему обеспечивают наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET с использованием флуоресцентных белков должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы улучшения флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут в дальнейшем революционизировать этот новый подход к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

Разработка флуоресцентных датчиков на основе комбинации ПЭТ (фотоиндуцированный перенос электронов) и FRET (резонансный перенос энергии Фёрстера) для обнаружения воды

Флуоресцентные датчики DJ-1 и DJ-2 с большим стоксовым сдвигом (SS) на основе комбинации PET (фотоиндуцированный перенос электронов) и FRET (резонансный перенос энергии Фёрстера) были разработаны для обнаружения вода в органических растворителях. DJ-1 состоит из эфира антрацен- (аминометил) фенилбороновой кислоты в качестве донорного флуорофора типа ПЭТ и скелета BODIPY в качестве акцепторного флуорофора в процессе FRET. Напротив, DJ-2 состоит из антраценового скелета в качестве донорного флуорофора и скелета сложного эфира BODIPY- (аминометил) фенилбороновой кислоты в качестве акцепторного флуорофора ПЭТ-типа в процессе FRET. Фактически, добавление воды к органическим растворителям, содержащим DJ-1 или DJ-2 , вызывало как подавление ПЭТ, так и передачу энергии от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору через процесс FRET, что приводило к усилению флуоресценции. группа, происходящая из скелета BODIPY.Кроме того, значения псевдо-SS DJ-1 и DJ-2 между максимумом фотопоглощения антраценового флуорофора и максимумом флуоресценции флуорофора BODIPY составляют 7563 см -1 (141 нм) и 8017 см -1 (153 нм), соответственно, что значительно выше, чем у типичного флуоресцентного датчика на основе ПЭТ. Было обнаружено, что эффективность FRET для DJ-1 является количественной, но для DJ-2 была оценена примерно в ок. 50% на основе измерений времени жизни флуоресценции с временным разрешением. Более того, предел обнаружения DJ-1 для воды превосходит предел обнаружения DJ-2 . Основываясь на механизме определения флуоресценции DJ-1 и DJ-2 для воды, мы предполагаем, что комбинация донорного флуорофора ПЭТ-типа и акцепторного флуорофора в процессе FRET является одной из наиболее многообещающих молекулярных конструкций для создать эффективный флуоресцентный датчик для обнаружения воды в органических растворителях.

Эта статья в открытом доступе

Подождите, пока мы загрузим ваш контент... Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo

Конструирование плазмиды

Комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая mTurquoise, и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart 43 .кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены с помощью сайт-специфического мутагенеза с помощью ПЦР. Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) 43 и K206A (для Turquoise2-GL). Прототип ERK-биосенсора активности FRET, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно 19 . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP.Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan). Точно так же CFP в PicchuEV-x 19,44,45 и RaichuEV-Ras 19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 с образованием hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно.В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов. Варианты NanoLuc hyBRET-ERK также были получены реакцией In-Fusion. CeNL, гибридный белок Turquoise2 и NanoLuc, был описан ранее 22 .Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS 47 или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) 48 . Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки кДНК-кодирующих компонентов hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (геном устойчивости к бластицидину) и оптимизированным по кодонам YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP 49 . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK был заменен на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК. Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена ​​в вектор CSII-EF с IRES-puro, а кДНК для голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря амплифицировали с помощью ПЦР и субклонировали в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов.pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее 50 . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion. Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548-1020) или интер-Sh3-доменом p85 человека (aa 428-621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 51 .Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена ​​перед последовательностью поли А. Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.

Культура клеток и создание стабильных клеточных линий

Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония).Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония). Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 на воздухе при 37 ° C.Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase 48 , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute. Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали с помощью 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем дополнительно культивировали в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T были котрансфицированы вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида № 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком от Dr.Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Warrington, PA). Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.

Реагенты

Диацетилцелентеразин-h синтезировали, как описано ранее 14 .Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония). Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и эпидермальный фактор роста были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использовался для липофекции плазмиды в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина.Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.

Спектроскопия

Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор помещали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25x36 (Semrock).YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus). Спектры флуоресценции регистрировали с интервалом 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12.Полученные спектры флуоресценции и люминесценции были использованы для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.

Оценка эффективности передачи энергии

Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны к теоретическим спектрам излучения, по существу, как сообщалось ранее 20 . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон).Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:

$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$

(1)

где F ( λ ) - флуоресценция на длине волны λ, ε c ( λ из ) - коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E CY - эффективность FRET между CFP и YFP, ϕ C - квантовая эффективность CFP, f C ( λ ) - нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ Y - квантовая эффективность YFP, f Y ( λ ) - нормализованное излучение YFP, а ε Y ( λ из ) - коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения. ε Y ( λ из ) значение при 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP ​​в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε Y ( λ из ) значение при 513 нм.

Предполагая, что внутрикадровое слияние RLuc8 на С-конце не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:

$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} - {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$

(2)

где B ( λ ) - интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E RC - это эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E RY - это эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ R - квантовая эффективность RLuc8, а f R ( λ ) - нормализованное излучение RLuc8.

E CY было оценено путем нелинейной аппроксимации измеренных спектров флуоресценции уравнением. 1. E RC считается постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ CNL , выражается следующим уравнением:

$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$

(3)

Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E RC было определено как 0,13. Наконец, E RY было оценено путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.2. Значения ε и ϕ перечислены в Таблице S1.

Скорость передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, была определена аналогично RLuc8-содержащим биосенсорам путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.

$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} - {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$

(4)

где B ( λ ) - интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E NC - это эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E NY - это эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ N - квантовая эффективность NanoLuc, а f N ( λ ) - нормализованное излучение NanoLuc.Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E NC , был также оценен по формуле. 4, установка E NY и E CY как ноль.

Покадровая визуализация культивируемых клеток

Покадровые изображения были получены и обработаны с использованием, по существу, тех же условий и процедур, что и ранее. 52 .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом в процессе покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см 2 в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить рассеянный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25x36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Для получения изображений BRET не использовалось дихроичное зеркало.

Обработка изображений

Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума 53 . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.

Optogenetics

Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать мембранную транслокацию слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом с длиной волны 490 нм (55 мкВт / см 2 ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см 2 ) или светом 490 нм (180 мкВт / см 2 ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).

Анализы на микропланшетном ридере

Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разведенным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью устройства для считывания микропланшетов GloMax Discover (Promega).Фильтр короткого прохода 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $$

(5)

Здесь SD - это стандартное отклонение, а Ave - это среднее значение желтой / голубой люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее 26 . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$

(7)

Здесь min - минимум, amp - амплитуда, IC50 - это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH - коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK - это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.

Образование опухоли ксенотрансплантатом и генерация трансгенных мышей

Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 6 клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 5 клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенные мыши были получены с помощью Tol2-опосредованного переноса гена 54 . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.

Биолюминесцентная визуализация всего тела животных

Для сравнения времени жизни биолюминесценции между аналогами целентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводимый коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для люминесцентной визуализации мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. / Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время воздействия 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25x36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.

Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши

Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому вентилятору MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *