Лада 4 фото: Фото Lada 4×4 — фотографии, фото салона Lada 4×4, I поколение

Если у вас есть интересные фото ВАЗ 2114, вы можете разместить их в фотофоруме.

Amazon.com: Персонализированный фотоальбом — нейтральный фон с розовыми буквами лада: Handmade

Настраиваемый

Что-то пошло не так.Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Что-то пошло не так. Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Покажите свои драгоценные фотографии в этом красивом персонализированном фотоальбоме. Общие размеры этого фотоальбома: 13 1/2 дюймов Д x 8 1/2 дюймов Ш x 2 1/4 дюйма В. Каждый альбом вмещает 204 фотографии размером 4 x 6 дюймов. Альбом выполнен в стиле с тремя кольцами и может вместить дополнительные страницы пополнения (продаются отдельно).Прозрачные карманы предназначены для боковой загрузки и фотобезопасности: без выбросов кислоты и полипропилена. ** Дополнительные элементы на фото в продажу не входят. Это объявление только для одного фотоальбома.

Сэкономьте 10 долларов в Prime Day, потратив 10 долларов на малый бизнес сегодня

9 основных гитарных аккордов, которые нужно знать начинающим! С фотографиями в помощь — Musicians HQ

Итак, вы хотите играть на гитаре. Потрясающие! Если вы запутались или не знаете, с чего начать, вы попали в нужную статью. Это простое руководство покажет вам гитарных аккордов с иллюстрациями, и гитарных аккордов с изображениями рук.

Я не могу обещать, что эти аккорды поначалу будут легкими, но они необходимы. Эти аккорды являются строительными блоками музыки, и знание их позволит вам исполнять широкий спектр популярных песен! Просмотрите список из 20 гитарных песен для начинающих до конца статьи.

Эти аккорды предназначены для начинающих, потому что это открытые аккорды, то есть есть струны, которые вы играете открытыми. Другое озвучивание этих аккордов требует запрета и более сложных положений пальцев. Эти 9 простых гитарных аккордов имеют простые формы, которые не сложно освоить.

Давайте разберемся с этими 9 основными гитарными аккордами для начинающих.

Как вы можете видеть на изображении выше, мы иллюстрируем гитарный аккорд с помощью таблицы аккордов. Прежде чем выучить какие-либо аккорды, вам нужно научиться читать таблицу. Это довольно просто:

• Вертикальные линии представляют струны гитары, как если бы вы смотрели на гриф прямо и прямо. Струна в крайнем левом углу — это нижняя E, а струна в крайнем правом углу — это высокая E. (Между ними находятся струны A, D, G и B).
• Горизонтальные линии представляют маркеры ладов. Пространство между каждой горизонтальной линией — лад.
• Более толстый черный блок в верхней части диаграммы представляет гайку гитары.
• Черные кружки показывают, куда вы кладете пальцы. (Ваши пальцы всегда проходят между маркерами ладов, а не поверх них)
• Кружки и крестики в верхней части таблицы показывают, играете ли вы на струне или нет. Круг означает, что вы играете на открытой струне (не трогаете эту струну), а X означает, что вы вообще не играете на струне.
• Буквы внизу таблицы, выровненные по строкам, иногда говорят вам, на какой высоте вы играете. Это очень полезно для изучения того, какие ноты составляют триаду!

Давайте разберем эти важные аккорды на части, чтобы сделать их более удобоваримыми.

Если вы только начинаете изучать гитару, эти четыре аккорда — до мажор, ля минор, фа мажор и соль мажор — позволят вам сыграть сотен , если не тысяч песен, многие из которых вы, вероятно, уже знаете. !

• До мажор — аккорд до мажор состоит из нот до, ми и G.

Вот как играть до мажор на гитаре:

• ля минор — аккорд ля минор состоит из нот A, C и E.

Вот как играть на гитаре ля минор:

• Фа мажор — аккорд фа мажор состоит из нот F, A и C.

Вот как играть фа мажор на гитаре:

Краткое примечание об аккорде фа мажор, аккорд фа мажор — сложный аккорд, который бросал вызов гитаристам с незапамятных времен . .. Если у вас возникнут проблемы, попробуйте другое озвучивание, ознакомившись с этой статьей, 8 способов сыграть фа-аккорд Feared на гитаре.(Эта форма, вероятно, самая простая, если вы начинающий гитарист, поскольку она не требует запретов.)

• G Major — аккорд G Major состоит из нот G, B и D.

Вот как играть G Major на гитаре:

Эти четыре аккорда представляют последовательность аккордов I-vi-IV-V в тональности C. С помощью этих четырех аккордов вы можете сыграть множество популярных песен.

Убрав эти четыре аккорда, вот еще 5 гитарных аккордов, которые вы часто встретите в песнях.

• Ре мажор — Аккорд ре мажор состоит из нот D, F # и A.

• Ре минор — Аккорд ре минор состоит из нот D, F и A.

• E Major — Аккорд E Major состоит из нот E, G # и B.

• ми минор — аккорд ми минор состоит из нот E, G и B.

• A Major — Аккорд A Major состоит из нот A, C # и E.

Уберите все эти гитарные аккорды, и вы сможете сыграть все эти песни! И если вы хотите испытать себя, я пометил некоторые, которые включают другие аккорды / вариации, не описанные в этой статье.

Если сейчас это кажется непосильным, не волнуйтесь! Это нужно запоминать, практиковать и совершенствовать. Если вы чувствуете себя подавленным, начните с аккордов C, Am, F и G. Эти четыре откроют вам больше всего возможностей начать играть на гитаре.

Хорошо, что музыка дает нам отправную точку, а еще лучше то, что так много запоминающихся песен следуют одному образцу. Просто продолжайте придерживаться этого, и вы сможете сыграть несколько хитов на следующей вечеринке!

Определение эффективности FRET в системах визуализации с помощью фотообесцвечивающих акцепторов

Принадлежности Расширять

Принадлежность

• ¹ Ключевая лаборатория атомных и молекулярных нанонаук Министерства образования, Департамент физики, Университет Цинхуа, Пекин, Китай.

Элемент в буфере обмена

Chuyun Deng et al. Таланта. 2010 .

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Принадлежность

• ¹ Ключевая лаборатория атомных и молекулярных нанонаук Министерства образования, Департамент физики, Университет Цинхуа, Пекин, Китай.

Элемент в буфере обмена

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) широко используется для определения расстояния между донором и акцептором в биологических исследованиях.Однако обнаружение эффективности FRET с помощью систем визуализации флуоресцентной микроскопии остается большой проблемой из-за трудностей перевода серых шкал изображений в интенсивности флуоресценции и отсутствия точных квантовых выходов доноров и акцепторов. Здесь мы представили новый метод определения эффективности FRET в системах визуализации путем анализа вызванных фотообесцвечиванием изменений интенсивности флуоресценции квантовых точек (квантовые точки, доноры) и красителей Cy5 (акцепторы). Наш метод отличается от предыдущих исследований акцепторного фотообесцвечивания в системах визуализации тем, что теоретически анализирует процесс отбеливания и предлагает новый параметр, который является универсальным для образцов того же типа.Это удобно для расчета эффективности FRET. Между 605QD и Cy5 практически нет спектральных перекрестных помех, поэтому результат FRET более точен, чем у многих других распространенных пар FRET. Длины одноцепочечных и двухцепочечных фрагментов ДНК в растворе определяли с помощью анализа значений эффективности FRET. Этот метод обеспечивает надежный подход к изучению биомакромолекул в живых клетках с помощью флуоресцентной визуализации и измерений in situ.

Авторские права 2010 Elsevier B.V. Все права защищены.

Похожие статьи

• Флуоресцентный резонансный перенос энергии между донорами квантовых точек и акцепторами белков, меченных красителем.

  Клапп А.Р., Мединц Иллинойс, Мауро Дж.М., Фишер Б.Р., Бавенди М.Г., Маттусси Х. Клапп А.Р. и др. J Am Chem Soc. 2004, 14 января; 126 (1): 301-10. DOI: 10.1021 / ja037088b. J Am Chem Soc. 2004 г. PMID: 14709096

• Могут ли люминесцентные квантовые точки быть эффективными акцепторами энергии с донорами органических красителей?

  Клапп А.Р., Мединц Иллинойс, Фишер Б.Р., Андерсон Г.П., Маттусси Х.Клапп А.Р. и др. J Am Chem Soc. 2005 2 февраля; 127 (4): 1242-50. DOI: 10.1021 / ja045676z. J Am Chem Soc. 2005 г. PMID: 15669863

• Исследования резонансного переноса энергии Фёрстера с использованием флуорофоров с квантовыми точками.

  Клапп АР, Мединц Иллинойс, Маттусси Х. Клапп А. Р. и др. Chemphyschem. 2006 16 января; 7 (1): 47-57. DOI: 10.1002 / cphc.200500217. Chemphyschem.2006 г. PMID: 16370019 Рассмотрение.

• Резонансный перенос энергии флуоресценции флуоресценции в фазе раствора.

  Понс Т., Мединц Иллинойс, Ван Х, английский Д.С., Маттусси Х. Понс Т. и др. J Am Chem Soc. 2006 29 ноября; 128 (47): 15324-31. DOI: 10.1021 / ja0657253. J Am Chem Soc. 2006 г. PMID: 17117885

• Визуализация белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентной резонансной микроскопии с переносом энергии.

  Kenworthy AK. Kenworthy AK. Методы. 2001 июл; 24 (3): 289-96. DOI: 10.1006 / meth.2001.1189. Методы. 2001 г. PMID: 11403577 Рассмотрение.

Процитировано

• Использование люминесцентных нанокластеров золота ближнего инфракрасного диапазона для обнаружения макрофагов.

  Сапожникова В., Уилси Б., Асмис Р., Ван Т., Дженкинс Дж. Т., Манкузо Дж., Ма Л.Л., Куранов Р., Милнер Т.Е., Джонстон К., Фельдман М.Д. Сапожникова В. и др. J Biomed Opt. 2012 Февраль; 17 (2): 026006. DOI: 10.1117 / 1.JBO.17.2.026006. J Biomed Opt. 2012 г. PMID: 22463038 Бесплатная статья PMC.

Типы публикаций

• Поддержка исследований, Non-U.С. Правительство

Условия MeSH

• Карбоцианины / химия
• Флуоресцентный резонансный перенос энергии / методы
• Флуоресцентные красители / химия

цитировать

Формат: AMA APA ГНД NLM

Guitar Shop 101: Как пропилить острые лады

Я всегда могу сказать, когда у нас была холодная зима, по гитарам, которые приходят в мой магазин. Когда люди включают тепло в холодную погоду, из воздуха удаляется влага. Гриф гитары может сжиматься в среде с низкой влажностью, в результате чего концы ладов немного выступают с обеих сторон грифа. Как правило, вы можете предотвратить это, используя увлажнитель воздуха в помещении или недорогое устройство для увлажнения гитары, но, как только острые концы ладов выступают наружу, вам нужно с ними справиться, потому что они делают игру на гитаре очень неудобной. Отремонтировать острые лады несложно, но для этого нужны подходящие инструменты и материалы, и вы должны знать, что делаете.

На фото 1 показан пример резких ладов. Это довольно новая гитара, но владелец, очевидно, никогда ее не увлажнял. На этом этапе концы ладов нужно подпилить, придать им форму и отполировать.

Фото 2

Для этой работы вам понадобятся два напильника: плоский напильник с мелкими зубьями (, фото 2, ) и трехугловой миниатюрный напильник (, фото 3, ), специально предназначенный для работы с резьбой.

Фото 3

Плоские напильники с мелкими зубьями бывают разных размеров и форм, их можно приобрести в специализированных компаниях по производству гитарных инструментов, таких как Stewart-MacDonald, Luthiers Mercantile и Allparts, а также в магазинах товаров для дома.Ищите пилку с мелкими зубьями длиной от 3 1/2 до 8 дюймов. Некоторые компании продают напильники с алмазным покрытием, и они тоже хорошо работают.

Я предпочитаю трехугольные миниатюрные напильники Nicholson, но большинство брендов справляются со своей задачей. Напильник с тремя углами идеально подходит для закругления сторон лада, и лучший тип для этой работы — напильник с одинарной резкой. Другими словами, зубья пилки режут только в одном направлении, что ограничивает скопление мусора.

Важно: Убедитесь, что вы скруглили и отшлифовали один из углов файла. В противном случае напильник может врезаться в гриф (и переплет, если он есть на гитаре). Я использовал ленточную шлифовальную машину, чтобы аккуратно удалить зубы с одного из краев файла. Если вы не хотите делать это самостоятельно, упомянутые выше поставщики гитарных инструментов продают трехугловые напильники со сглаженными передними кромками, предназначенные для лепки.

Фото 4

Филе ладов концы. Первый шаг — подпилить выступающие концы ладов заподлицо с грифом. Прижмите плоскую пилку с мелкими зубьями к боковой поверхности грифа и осторожно перетащите пилку от первого лада вниз до последнего лада ( Фото 4 ).Позвольте инструменту делать свою работу — вы просто им управляете. Если вы нажмете слишком сильно, вы можете порезаться на грифе или переплете.

После того, как лады будут подшиты заподлицо с грифом, слегка наклоните плоский напильник — примерно от 35 до 45 градусов — и скользите по концам ладов, пока они не получат равномерный скос. Но убедитесь, что вы не добавили слишком много фаски. Если скос слишком длинный, струны E могут соскользнуть с ладов при игре.

Отремонтировать острые лады несложно, но для этого нужны подходящие инструменты и материалы, и вы должны знать, что делаете.

Когда концы ладов с обеих сторон грифа выглядят одинаково и гладко, вы готовы к следующему шагу.

Закругление кончиков ладов. Эта операция требует терпения и навыков. Цель состоит в том, чтобы сгладить края ладов там, где они встречаются с грифом, чтобы лады не казались острыми. Используя специальную трехугловую пилку, поместите «беззубый» край вниз, в сторону грифа, и аккуратно перекатите пилку по краю ладового конца ( Фото 5, ).Чтобы сгладить лад, достаточно трех или четырех мягких движений.

Повторите этот процесс для каждой стороны каждого лада, пока все лады не станут гладкими и округлыми. Всегда следите за файлом, особенно когда работаете над телом. Вы же не хотите срезать или выдолбить этот верх! Пилить медленно и методично. Если вы хотите защитить гитару, вы можете использовать малярный скотч с низкой липкостью, чтобы замаскировать уязвимые места.

Фото 5

Удаление следов инструмента. Пришло время навести порядок. Используя однолезвийную бритву, осторожно потрите гриф взад и вперед, пока все следы инструмента не исчезнут (, фото 6, ). Легкими прикосновениями не соскребайте слишком много дерева. Цель состоит в том, чтобы удалить минимальное количество материала, необходимого для сглаживания следов.

Полировка кончиков ладов. Следующий шаг — использовать сверхтонкую полировальную бумагу, которая доступна во многих стилях (включая салфетки с микрочастицами и «ластики» для ладов в последовательной серии зерен) от поставщиков ювелирных изделий и компаний, производящих аксессуары для гитар, таких как Dunlop и Planet Waves. .

Возьмитесь за полировочную бумагу или ткань и осторожно потрите концы ладов вдоль грифа. Это придает ладам красивый блестящий вид. Пока вы занимаетесь этим, почему бы не отполировать вершины всех ладов?

Фото 6

Кондиционирование грифа. Последний шаг в нашем процессе — кондиционирование грифа. Существуют десятки средств для чистки и кондиционирования открытых необработанных деревянных досок гитары. Путем небольшого исследования и некоторых проб и ошибок вы найдете продукт, который вам подходит.

Нанесите кондиционер на гриф и потрите его старой зубной щеткой. Это удалит скопившуюся грязь и пот, а также поможет древесине впитать кондиционер. Когда гриф полностью покрыт, вытрите его бумажным полотенцем.

Прощальные мысли. Как мы видели, основной причиной острых концов ладов является недостаток влажности. Оптимальный уровень влажности для любой гитары составляет 40-50 процентов. Кондиционирование грифа помогает свести к минимуму проблемы с влажностью, но все же крайне важно, чтобы ваша гитара оставалась влажной.Итог: стоит попробовать различные увлажнители для гитары. Разработанные, чтобы поместиться в корпус или футляр гитары, они недороги и просты в использовании. Увлажнители могут предотвратить появление острых кончиков ладов и сэкономить массу работы.

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов.В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов. Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом исследования взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале. Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.Используя этот метод, молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов. Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же соседстве, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Флуоресцентная визуализация с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает из-за относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применяя методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на , рис. 1, ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привели к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (одиночный генетически кодируемый конструкт), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за различной стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F люоресценция C комплементация; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция под названием cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов в начало седьмой beta -цепи в остове флуоресцентного белка. Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных концов N и C и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками , могут быть объединены с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на изменениях протонирования нативного (дикого типа) GFP, которые приводят к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в реальном времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. Рисунок 2 ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать датчик во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и уменьшении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

E _FRET = 1 / [1 + (r / R ₀ ) ⁶ ]

, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно рассчитать для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Фёрстера и обсуждается ниже более подробно).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний меньше R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний больше R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на рис. 3 (а) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET можно эффективно использовать в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только между с высоким FRET, и с низким FRET, или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или забуференном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:

R ₀ = [2,8 x 10 ¹⁷ × Κ ² × Q _D × Ε _A × J (λ)] ^1/6 нанометров

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя диполями флуорофора (см. Рисунок 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) — квантовый выход донора, Ε (A) — максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) — интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает на то, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами примерно так же, как положение радиоантенны может влиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень совмещения определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может изменяться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Почти для любой реалистичной ситуации Κ (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы изменить это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам). Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, которые возникают из-за изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как в другом канале преобладает систематический шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET. Из-за того, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по межбелковому взаимодействию, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия является фиксированной и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозного прохождения (также называемое перекрестными помехами и перекрестным перекрестным возбуждением ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. Рисунок 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора (, рис. 5 (а), ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора значительно перекрываются (, рис. 5 (b), ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, которые хорошо разделены спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имеют значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Ферстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждая из описанных выше проблем может быть смягчена (или частично) осознанным выбором пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET. Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, рис. 5 (а), ), так и излучения (, рис. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (a) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP (, рис. 5 (b), ) демонстрирует значительное перекрытие по интенсивности во всем диапазоне излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, поскольку каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, возникающих в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

• Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
• Фотообесцвечивание акцептора — Этот метод, также известный как расщепление донора , измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
• Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — Измерение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
• Спектральная визуализация — Возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
• Флуоресцентная поляризационная визуализация — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Сенсибилизированное излучение

Также обычно называемый двухцветной визуализацией с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для получения изображений с сенсибилизированным эмиссионным FRET разработано множество корректирующих подходов. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированное излучение является особенно привлекательным методом при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, проиллюстрированный на рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля, когда пептидный линкер ферментативно расщепляется. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцепторное фотообесцвечивание

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и что акцептор фотообесцвечивается примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормирования этого значения на интенсивность донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, ограничивая его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 являются примерами FRET-анализа сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцептора с использованием визуализации живых клеток. Фиг. 6 (a) иллюстрирует эпителиальную клетку карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующую биосенсор Cameleon, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) в фиг.6 (d) — (f) были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фиг.6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фиг.6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и направленный на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рис. 6 (е) ) увеличивает расщепление донора (увеличение зеленой флуоресценции на рис. 6 (е) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале. Только.

Флуоресцентная микроскопия для непрерывной визуализации (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.