Большой тест: Kia Rio X-Line, Renault Sandero Stepway, Lada X-Ray Cross | Тест-драйвы
Способ переделки обычного хетчбека в кросс-хетч довольно прост: пару сантиметров к дорожному просвету, за счет удлиненных пружин и штоков амортизаторов, плюс пластиковый обвес по нижнему периметру кузова. По такому рецепту сделаны Kia Rio X-Line и Renault Sandero Stepway. У Лады X-Ray Cross отличий от донорского Иксрея на два порядка больше. Кроме новых упругих элементов – «по кругу», тут оригинальный передний подрамник в купе с рычагами и поворотными кулаками. А так же новый электроусилитель руля калужского завода «Автоэлектроника».От обычного Иксрея, Cross отличается не только обвесом и колесами, но и бамперами с продолжением х-образных подштамповок
Передняя колея X-Ray Cross шире на 19 мм, а задняя на все 54 мм. Любопытно, но инициаторами широкой колеи были не инженеры, а главный вазовский художник Стив Маттин. Англичанин настоял на том, что бы колеса кросс-хетча стояли ближе к аркам, так по мнению мэтра, автомобиль выглядит цельно сбитым и основательным. Кто бы спорил! Кроме того Маттин хотел установить на Cross 18-дюймовые колеса, но после обсуждения заводчане сошлись на компромиссной обувке R17. Что для компактной машинки В-класса тоже не мало. К примеру, Kia и Renault укомплектованы колесами на размер меньше.
Угловатый дизайн передней панели Лады – на любителя. Однако в отличии от Renault рулевая колонка регулируется по углу наклона и вылету, что обеспечивает водителю более удобную посадку
Среди участников теста, только у вазовского паркетника есть внедорожный ассистент. Система Lada Ride Select попутно отвечает и за активацию спорт-режима. Кроме того тут новые передние кресла и регулируемая по вылету рулевая колонка. Пусть диапазон перемещения телескопического механизма всего 42 мм, но это именно те миллиметры, которые позволяют распрямить конечности и найти более удобную посадку, чем в соплатфоменном Sandero.
Система Lada Ride Select не заменит механический полный привод, но и считать оную бесполезной безделушкой тоже не стоит. Мы проверили – на бездорожье ассистент реально помогает
Среди мелких изменений интерьера: именные накладки на порогах, комбинация приборов с оранжевой подложкой, а так же обогревы руля и сидений. Причем передние грелки – трехрежимные, с автоматическим снижением интенсивности нагрева. У обычного Иксрея таких нет. Наконец у «Кросса» улучшена шумоизоляция салона. Кроме снижения шума как такового, это положительно повлияло и на звучание штатной аудиосистемы. При тех же компонентах, что и у Renault «музыка» в Ладе играет детальней и глубже.Недавний рестайлинг освежил внешность Степвея добавив недорогому хетчбеку лоска
У Sandero Stepway, построенного на той же несовершенной платформе В0, что и X-Ray Cross регулируемой по вылету рулевой колонки как не было так и нет. Посадку водителя усугубляет кресло неоптимальной формы: подушка тут уж очень короткая, спинка плохо фиксирует тело, а подголовник не обеспечивает опоры затылку. Нет тут и камеры заднего вида, которая присутствует в дорогих версиях Лады и Kia, а так же обогревов руля и заднего дивана. Зато на втором ряду места чуть больше, чем в соплатформенном Иксрее, а сама «сидушка» с мягким наполнителем более удобна.
В интерьере Stepway не найти отличий от обычного Sandero. Пластик жесткий, но качество материалов вполне приличное
Но комфортней всего пассажирам будет в Kia. По запасу пространства на втором ряду Rio X-Line – рекордсмен. Да и водителю грех жаловаться, под ним отлично спрофилированное кресло. Перед глазами читабельная комбинация приборов с крупными шкалами, эргономика продумана до мелочей: все крутилки-кнопочки на своих местах, искать ничего не приходится. Жаль дисплей мультимедийной системы мелковат и расположен почти вертикально. На солнце экранчик нещадно бликует.
Впрочем, за Renault и Ладой водится тот же грешок.
Обычный хетчбек Rio в России не представлен, альтернатива седану предлагается с псевдовнедорожным пакетом X-Line
Еще отметим, что в Kia самая легковая посадка, как в обычном Rio – привыкать и переучиваться не придется. Водители соплатформенных Sandero Stepway и X-Ray Cross восседают над дорогой заметно выше. С одной стороны капитанская посадка обеспечивает лучшую обзорность, с другой – присутствует некое ощущение отстраненности от автомобиля. Со временем к этой особенности привыкаешь, но на первых порах подсознательно тянешься рукой к домкратику регулировки кресла, что бы опуститься пониже.
Эргономика продумана почти до мелочей, но искать мягкий пластик в салоне Rio X-Line бесполезно
Наиболее широкий выбор силовых агрегатов у Renault. Кроме старых моторов К4М (1.6 л., 82 л.с. и 1.6 л., 102 л.с.), в гамме присутствует ниссановский движок того же объема (113 л.с.). И трансмиссии, что называется в ассортименте: «механика», «автомат», вариатор. У Kia два мотора (1.4 л., 100 л.с. и 1.6 л., 123 л.с.) и две шестиступенчатых коробки: «механика» и «автомат». А вот у Лады альтернативы «атмосфернику» 1.8 л. (122 л.с.) агрегатированным с пятиступенчатой механической трансмиссией нет. «Робот» АМТ, как и двигатель 1.6 – в перспективе.
Renault Sandero Stepway
Kia Rio X-Line
Lada X-Ray Cross
С маркетинговой точки зрения отсутствие двухпедальной модификации – серьезный «косяк». Но и физически X-Ray Cross с «механикой» далек от совершенства. Что бы тронуться с места без рывка приходится ювелирно работать совершенно неинформативным акселератором и длинноходным сцеплением. Чуть ошибся и Lada прыгает с места. Легковесная педаль газа усложняет движение в пробках, а также на грунтовке, когда нужно проехать неровный участок черепашьим шагом. Управляемость с перчинкой.
В повороте задняя ось доворачивает кросс-хетч по вертикальной оси. Однако заноса можно не опасаться, благодаря толково настроенной системе стабилизации
Двигатель 1.8 тоже – вещь в себе. На холостом ходу он не только нагружает вибрациями органы управления, но и заполняет салон громким и не слишком приятным уху урчанием. До 2000 об/мин движок с индексом 21179 спит крепким сном, лишая возможности двигаться в натяг. Зато преодолев трехтысячную отметку тахометра, просыпается активным подхватом, который не скисает вплоть до электронной отсечки. В общем, гонять на X-Ray Cross куда проще и интересней, чем двигаться в рамках законопослушных скоростей.В движении превалирует голос мотора, который перекрывает шум шин и завывания ветра
К механической коробке вопросов считай нет. Ходы невелики, избирательность рычага на твердую «четверку». Жаль передач тут всего пять, причем довольно коротких. Разогнавшись, так и хочется подоткнуть несуществующую, шестую ступень, что бы приглушить навязчивый шум мотора и снизить его аппетит. Все таки девять литров «на сотню» в смешанном цикле, многовато, для столь компактного автомобиля.На газ Renault реагирует с ощутимыми задержками. Разгонная динамика самая скромная из участников теста
Однако 113-сильный Sandero Stepway при том же темпе движения потребляет еще где-то на 0,3 литра больше. А если на полдня застрять в глухой пробке, на дисплейчике комбинации приборов и вовсе высветится «десятка». При этом какой то выдающейся динамикой Renault не отличается: не густо, но и не пусто, в общем – середнячок. А вот ниссановский вариатор, который начали ставить на Степвэи после рестайлинга порой заслуживает крепкого словца. Нет, сам агрегат в принципе не плох: умело имитирует смены передач, не размазывает сопли по шкивам при интенсивных разгонах и даже тормозит двигателем при снижении скорости. Однако из-за неудачных настроек электронного софта, реагирует на подачу топлива с неприличной задумчивостью, что бы добиться сколь ни будь заметного ускорения, педаль газа приходится прожимать аж на половину хода.
Но и после этого приходится ждать: сначала повышаются обороты мотора и только после этого автомобиль начинает нехотя ускоряться.Подвеска Renault дает меньше комфорта, нежели Lada и тем более Kia, Но при этом его салон лучше других изолирован от внешних шумов
Rio X-Line жертвоприношений не требует. Переводишь селектор классического «автомата» в драйв, добавляешь тягу точным акселератом и корейский «кроссовок» мягко отчаливает с места. Хочешь ускоряйся плавно, хочешь – жги резину в пробуксовке колес, Kia с легкостью принимает любые правила игры. Причем всегда выполняет команды, так как ожидает водитель. Ну почти всегда.В поворотах Rio X-Line демонстрирует завидную стабильность и нейтральные повадки. Обратная связь на руле возрастает равномерно углу поворота рулевого колеса
Управляется Kia надежно. Руль на малых скоростях почти невесом, но с ростом скорости тяжелеет, позволяя вести автомобиль по прямой без вихляний и подруливаний. При отклонениях баранки появляется и обратная связь. Крены кузова в поворотах не пугают, достигнув предела по сцеплению шин Rio X-Line безопасно смещается наружу поворота в сносе передних колес. Одним словом – отличник.В движении салон Rio X-Line наполняется шинным гулом
Sandero Stepway едет иначе. Руль неоправданно тяжел во всех режимах, вместо обратной связи – густое фоновое усилие.
Да и крены в поворотах самые ощутимые из всей троицы. Зажигать на Renault как-то не тянет. А вот X-Ray Cross будто сам подначивает водителя промчать по извилистой дорожке. Пусть руль Лады отличается слишком высоким возвратным усилием, но при этом выдает самую честную информацию о положении управляемых колес. В быстрых поворотах задняя ось немного доворачивает кроссовер, смещая баланс управляемости в сторону избыточности. Но от скольжений ее страхует строгая система стабилизации.Kia Rio X-Line
Багажный отсек Kia с простенькой отделкой вмещает 390-1075 л поклажи. Под полом полноразмерное запасное колесо
Renault Sandero Stepway
Багажник Renault объемом 320 л отделан опрятней чем в Kia, но лишен фурнитуры в виде крючков и кармашков. В нише лежит полноразмерное запасное колесо
Lada X-Ray Cross
Только в багажнике Лады есть двухуровневый пол. Но даже если удалить перегородку, объем отсека составит скромные 361 л. Запасное колесо – полноценное
Подвеска Sandero Stepway менее всеядна.
При попадании колеса в яму комфорт в салоне почти не страдает, но если на пути бугорок или тот же лежачий полицейский, тряханет так, что можно и язык прикусить. Судя по всему, из-за лифтинга кузова, амортизаторы Renault по разному работают при отбое и сжатии. Но вот, что интересно, стоит выехать на Степвэе на неровный проселок и от рассогласованности не остается и следа. По колдобинам можно мчать на всех парах. X-Ray Cross в тех же условиях ни чуть не хуже, а вот Rio X-Line отстает. Из-за меньшего дорожного просвета и внушительного переднего свеса за рулем Kia приходится тщательнее выбирать маршруты, а иногда и искать пути объезда.
| Кузов | |||
| Колесная формула / ведущие колеса | 4 х 2 / передние | 4 х 2 / передние | 4 х 2 / передние |
| Расположение двигателя | переднее поперечное | переднее поперечное | переднее поперечное |
| Тип кузова / количество дверей | кроссовер / 5 | кроссовер / 5 | кроссовер / 5 |
| Количество мест | 5 | 5 | 5 |
| База, мм | 2592 | 2592 | 2592 |
| Колея передних / задних колес, мм | 1503 / 1546 | 1503 / 1546 | |
| Дорожный просвет, мм | 215 | 215 | 215 |
| Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом вариантах, л | 361 / 1207…1514 | 361 / 1207…1514 | 361 / 1207…1514 |
| Длина / ширина (по зеркалам) / высота, мм | 4171 / 1810 (1983) / 1645 | 4171 / 1810 (1983) / 1645 | 4171 / 1810 (1983) / 1645 |
| Двигатель | |||
| Код двигателя | h5M | 21179 | 21129 |
| Тип двигателя | бензиновый | бензиновый | бензиновый |
| Система питания | впрыск топлива с электронным управлением | впрыск топлива с электронным управлением | впрыск топлива с электронным управлением |
| Количество, расположение цилиндров | 4, рядное | 4, рядное | 4, рядное |
Рабочий объем, куб. см | 1598 | 1774 | 1596 |
| Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин. | 83 (113) / 5500 | 90 (122) / 5900 | 78 (106) / 5800 |
| Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин. | 152 / 4000 | 170 / 3700 | 148 / 4200 |
| Топливо | бензин 92, 95 | бензин 92, 95 | бензин 92, 95 |
| Динамические характеристики | |||
| Максимальная скорость, км/ч | 162 | 180 | 165 |
| Время разгона 0-100 км/ч, с | 12,3 | 10,9 | 13,5 |
| Расход топлива | |||
| Городской цикл, л/100 км | 9,1 | 9,7 | 9,7 |
| Загородный цикл, л/100 км | 5,9 | 6,3 | 5,9 |
| Смешанный цикл, л/100 км | 7,1 | 7,4 | |
| Масса | |||
| Снаряженная масса, кг | 1275…1300 | 1275…1300 | 1275…1300 |
| Технически допустимая максимальная масса, кг | 1650 | 1650 | 1650 |
| Максимальная масса прицепа без тормозной системы / с тормозной системой, кг | 600…650 / 800 | 600…650 / 800 | 600…650 / 800 |
| Объем топливного бака, л | 50 | 50 | 50 |
| Трансмиссия | |||
| Тип трансмиссии | AT | 5МТ | 5МТ |
| Передаточное число главной передачи | 3,9 | 4,2 | 3,9 |
| Подвеска | |||
| Передняя | независимая, типа Макферсон, пружинная, с гидравлическимиили газонаполненными телескопическими амортизаторами, состабилизатором поперечной устойчивости | независимая, типа Макферсон, пружинная, с гидравлическимиили газонаполненными телескопическими амортизаторами, состабилизатором поперечной устойчивости | |
| Задняя | полузависимая, рычажная, пружинная, с гидравлическими илигазонаполненными телескопическими амортизаторами | полузависимая, рычажная, пружинная, с гидравлическими илигазонаполненными телескопическими амортизаторами | полузависимая, рычажная, пружинная, с гидравлическими илигазонаполненными телескопическими амортизаторами |
| Рулевое управление | |||
| Рулевой механизм | шестерня-рейка | шестерня-рейка | шестерня-рейка |
| Шины | |||
| Размерность | 215/50 R17 (91, H) | 215/50 R17 (91, H) | 215/50 R17 (91, H) |
(113 л.с.), АТ»>
1503 / 1546
8 л 16-кл. (122 л.с.), 5МТ»>
7,5
6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ»>
независимая, типа Макферсон, пружинная, с гидравлическимиили газонаполненными телескопическими амортизаторами, состабилизатором поперечной устойчивостиRenault Sandero Stepway против Lada XRAY
Не секрет, что французский концерн активно участвует в разработках и развитии АвтоВАЗа. Модель «Икс-Рэй» — это уже новый, совместный продукт, отличающийся не только неплохой проходимостью, но и достойным качеством и оснащением. За основу данного автомобиля был взят Renault Sandero Stepway. Поэтому многие отечественные водители хотят определиться, какой из двух хетчбэков лучше.
Сравнение экстерьера Renault Sandero Stepway и Lada XRAY
Дизайн «Икс-Рэй» многие автовладельцы и блогеры отмечают в числе главных плюсов модели. С другой стороны, броские Х-образные выштамповки далеко не всем водителям кажутся удачным решением.
При сравнении экстерьера Renault Sandero Stepway и Lada XRAY сразу заметно различие в позиционировании.
Российский хетчбэк изначально создавался как более доступная альтернатива французскому. Среди наиболее очевидных отличий — отсутствие пластикового обвеса и рейлингов, а также меньший диаметр колесных дисков в базе.
Не так давно в модельном ряду «Лады» появилась улучшенная кросс-версия «Икс-Рэй». В ней пластиковый обвес и рейлинги уже появляются, но и стоить данная версия будет уже ощутимо дороже «Сандеро Степвэй».
Французская модель очертаниями кузова больше похожа на SUV. Можно согласиться с тем, что в версии АвтоВАЗа автомобиль выглядит более внушительно, зато хетчбэк от «Рено» выигрывает по элегантности, собранности и динамичности облика. Общими преимуществами для обеих моделей являются внушительный клиренс в 195 миллиметров и защита картера, устанавливаемая по умолчанию.
Сравнение интерьера
«Степвэй» оказывается более выгодным вариантом и при сравнении интерьера. Он превосходит оппонента в плане качества материалов и эргономики салона. Цветовая гамма исполнения внутреннего пространства у «Рено» более строгая, а потому ощущается дороже. Аналогичное ощущение возникает при сопоставлении приборной панели и самих датчиков.
Оснащение начальных комплектаций «Лады» беднее. В первых двух исполнениях отсутствует даже кондиционер. «Икс-Рэй» догоняет «Сандеро» по функциональности только в топовой версии, а цена на нее уже чуть выше.
Но самым главным преимуществом «Рено» является включение в комплектацию не только фронтальных, но и боковых эйрбэгов. У «Лады» они недоступны даже в списке опций заметно более дорогой кросс-версии.
Сравнение ходовых характеристик
По мощности моторов есть небольшая разница в пользу «Лады». Для модели предлагаются 106- и 122-сильные двигатели объемом 1.6 и 1.8. У «Рено» сама линейка силовых агрегатов обширнее. Для «Сандеро Степвэй» доступны 82-, 102- и 113-сильные 1,6-литровые двигатели.
Соответственно, за российским хетчбэком сохраняется преимущество и при сравнении ходовых характеристик.
Однако разница здесь чисто номинальная и в реальной жизни не ощущается. «Икс-Рэй» потратит 11,1, а «Сандеро» — 10,4 секунды для разгона до 100 км/ч. Логичным следствием этого является чуть меньший расход топлива у французской модели, экономия также небольшая – 0,3 литра (6,9 в смешанном цикле).
Вместе с тем у «Рено» есть одно важное преимущество перед машиной от АвтоВАЗа — это наличие среди перечня предлагаемых КПП не только механики и вариатора (в исполнении City), но и классического автомата. Применяемая в машине японская АКПП заслужила репутацию безукоризненно надежной и ресурсной.
Итог сравнения
Подводя итог сравнения, можно заключить что «Сандеро» во многих отношениях является более выгодным вариантом. Французский автомобиль выигрывает по безопасности, эргономике, уровню оснащения, а также стоимости. Что касается дизайна салона и экстерьера, то у модели «Степвэй» они производят впечатление более дорогих, чем у отечественного конкурента.
Провести собственное сопоставление Renault Sandero Stepway против Lada XRAY и сделать выводы самостоятельно вы сможете после прохождения тест-драйва. В Красноярске расположены сразу два автосалона «СИАЛАВТО» — официального дилера «Рено». Вас ждут на проспекте Котельникова, 20, и улице Пограничников, 101а. Для записи на тест-драйв просто воспользуйтесь онлайн-формой на сайте.
: Технологии и медиа :: РБК
Российские студенты из Сибири разработали первый в мире беспилотный катафалк.
Транспортное средство, созданное на базе Lada Kalina, способно развивать скорость до 5 км/ч. Об этом сообщили ТАСС в НТИ «Автонет», занимающейся поиском и поддержкой перспективных проектов в сфере автотранспорта.
Проект отправлен на значительную доработку, выделение финансирования на его реализацию не предполагается, заявили в «Автонете». В организации сообщили, что студентов проконсультируют специалисты — разработчики высокоавтоматизированного транспорта. «Финансирования для него [проекта] не предполагается. Сейчас их платформа развивает скорость до 5 км/ч. Они нашли ему применение в качестве похоронного транспортного средства, предназначенного для перевозки умерших на территории кладбищ», — сообщили в «Автонете».
«Роскосмос» показал разработанный своей «дочкой» беспилотный трактор Технологии и медиаВ «Автонете» выразили надежду, что авторы проекта смогут увеличить скорость своей разработки, что позволит найти ей другое применение. При этом представитель организации Ярослав Федосеев отметил, что, по его мнению, беспилотные технологии уже нашли применение во многих областях, в число которых может в будущем войти сфера ритуальных услуг.
В России активно разрабатываются проекты по развитию и внедрению беспилотного транспорта. Ранее в «Яндексе» заявили о начале тестирования беспилотных автомобилей в Москве. До конца 2019 года компания намерена вывести на дороги более 100 машин. В будущем число тестовых регионов планируется увеличить до десяти, что позволит совершенствовать технологию.
Новый 8-клапанник ВАЗ-11182 — КОЛЕСА.ру – автомобильный журнал
Тюнинг моторов ВАЗов – направление, которое существует по меньшей мере лет 30.
Полно рецептов, как снять с мотора номинальной мощностью 80 л.с. все две сотни «лошадок», не говоря уж о повышении отдачи на 25-30 %! Но заводская модификация тем и отличается от тюнинга, хоть «гаражного», хоть «фирменного», что перед инженерами не стоит задача поднять мощность любой ценой. Они должны обеспечить правильный баланс массы показателей, многие из которых находятся в прямом противоречии друг с другом. И создание нового двигателя ВАЗ-11182 как раз и является примером такой работы. Ну а чтобы разобраться в этом непростом вопросе, мы воспользовались тем, что на тесте нового Lada Largus, который и будет оснащаться новым двигателем, присутствовал начальник бюро расчетов и валидации силовых агрегатов АвтоВАЗа Андрей Михайлович Аввакумов. Упустить такую возможность было бы просто грешно, и мы хотим поделиться с вами тем, что удалось выяснить в ходе весьма продолжительной беседы.
Пожалуй, историю 1,6-литровых восьмиклапанников можно отсчитывать с 1985 года, когда в гамме двигателей ВАЗ появился 1,5-литровый карбюраторный мотор с индексом 21083. Изначально он развивал 51,5 кВт, то есть 70 л.с. при 5600 оборотах, на бензине АИ-93, и был получен из более раннего 1,3-литрового мотора ВАЗ-2108 путем увеличения диаметра цилиндров. Естественно, это потребовало внесения в конструкцию массы радикальных изменений. Этот двигатель в начале своего жизненного цикла стоял под капотом Lada Samara и автомобилей десятого семейства.
В 1988 году появилась модификация двигателя ВАЗ-21083, оснащенная измененной шатунно-поршневой группой с плавающим поршневым пальцем и оригинальным распределительным валом. Мощность мотора ВАЗ-2110 составляла 52 кВт (70,7 л.с.), но уже на бензине АИ-91 – СССР к тому времени пытался унифицироваться по маркам бензина с Европой. Вместо АИ-93 появились АИ-91 и АИ-95. По ряду причин АИ-91 не прижился, уступив АИ-92.
Следующим важным этапом стало появление в 1996 двигателя ВАЗ-2111, впервые в истории АвтоВАЗа оснащенного системой впрыска.
Это позволило, при сохранении мощности на уровне 70 л.с., получить соответствие нормам выбросов Евро-2.
В дальнейшем появилось несколько модификаций двигателя ВАЗ-2111 с мощностью от 51,5 кВт (70 л.с). до 56,4 кВт (76,7 л.с.), соответствующих нормам токсичности от R83 до Евро-3. Начиная с норм Евро-2, появился фазированный впрыск топлива. Двигателями ВАЗ-2111 (наравне с карбюраторными двигателями 21083 и 2110) комплектовались как Lada Samara, так и 2110.
В 2004 году на выставочной площадке в Тольятти был показан новый мотор с индексом 21114/ 21183 объемом 1,6 л. Интересный факт: один двигатель имел два обозначения, так как он выпускался в двух разных цехах. Моторы были полностью идентичными.
Новинкой планировалось оснащать ВАЗовские новинки – семейства Kalina и Priora. Главной целью модернизации было увеличить крутящий момент на низких оборотах.
Двигатель Лада КалинаНа этот раз конструкторы нарастили объем цилиндров за счет увеличения хода поршней и отказались от попарно-параллельного впрыска топлива, остановившись на фазированном. Замена подпольного нейтрализатора катколлектором (нейтрализатором, устанавливаемым непосредственно возле головки цилиндров) значительно увеличила сопротивление системы выпуска, однако увеличение рабочего объема позволило достичь мощности в 59,5 кВт (80,9 л.с.)
Мотор при этом соответствовал нормам выбросов ЕВРО-3 и 4.
Дальнейшая эволюция была связана с внедрением в 2011-м году облегченной шатунно-поршневой группы, овального катколлектора с уменьшенным сопротивлением, электронного дроссельного патрубка, полуавтомата натяжения зубчатого ремня привода ГРМ, эластичного ремня привода вспомогательных агрегатов на двигателях с индексами 21116/ 11186 и 11189, которые развивали мощность до 64 кВт (87 л.с.) и соответствовали нормам ЕВРО-5 и 5+. К сожалению, на этой модификации двигателя поршень стал «втычным» (то есть при обрыве ремня ГРМ гнуло клапаны), что значительно сократило долю симпатий потребителей.
При модернизации двигателя 21116/11186 для Lada Vesta мотор получил измененные системы впуска, выпуска и подвеску, а заодно и индекс 11189.
Тем не менее, не встав под капот Весты по маркетинговым соображениям, с 2015 года двигатель 11189 стал применяться на Ларгусе. С июля 2018 года его поршню была возвращена «безвтычность» с одновременной оптимизацией бокового профиля поршня и заменой антифрикционного покрытия юбки на более износостойкое, что практически исключило задиры поршня при холодном пуске и движении в непрогретом состоянии.
Ну а вершиной этой восьмиклапанной эволюции и стал представленный в 2021 году двигатель ВАЗ-11182.
Возникает закономерный вопрос: а зачем вообще держаться за схему с двумя клапанами на цилиндр, если еще в 1992 году ВАЗ показал опытный образец «десятки» с 16-клапанным двигателем ВАЗ-2112, развивавшим 94 л.с., то есть на 16 л.с. больше, чем восьмиклапанный аналог (об истории создания этого мотора мы рассказали весьма подробно). Да и Lada Largus оснащается 106-сильным 16-клапанным ВАЗ-21129…
Планируя модернизацию восьмиклапанного двигателя, заводские конструкторы поставили себе планку – не делать максимальную мощность выше 67,5 кВт или 90 л.с. (с точки зрения физики данное равенство необъяснимо, и оно полностью остается на совести налоговиков).
Дело в том, что производители, которые выпускают автомобили с двигателями мощностью более этого значения, платят дополнительный акциз (увеличивающийся к тому же год от года), что неизбежно приводит к удорожанию автомобиля.
Тогда, может быть, проще было бы дефорсировать 16-клапанный двигатель? Нет, не проще. У 16-клапанников другая головка, два распредвала, больше клапанов, то есть стоимость самого агрегата оказывается существенно выше. Ну а поскольку одной из задач было сохранение конкурентоспособной цены на новый автомобиль, то 8-клапанный мотор посчитали оптимальным вариантом для бюджетных версий, более доступных для массового потребителя.
При этом 8-клапанник оказался даже лучше приспособлен к эксплуатации в городских условиях – за счет более благоприятной для субъективного восприятия кривой крутящего момента езда в городе становится более комфортной.
Да, на трассе 16-клапанник, конечно же, будет выигрывать – у него и мощность больше, и максимальная скорость получается выше. Но для легкого коммерческого автомобиля с уклоном в универсальность скорость – это все-таки не главное. Largus – автомобиль достаточно тяжелый, снаряженная масса – от 1300 кг в зависимости от комплектации. Поэтому для такого автомобиля крутящий момент на низких оборотах оказывается более важен, нежели пиковая мощность. И вот в погоне за моментом на низах вазовские конструкторы добились весьма серьезного прогресса. Да, мощностные показатели не поражают воображения, но этого и не требуется от двигателя бюджетного сегмента. Важно, что улучшение есть, оно субъективно заметно при тестировании автомобилей, и это улучшение достигнуто при минимальной стоимости изменения конструкции.
Как известно, главную информацию о моторе дает диаграмма ВСХ, внешней скоростной характеристики, показывающей зависимость крутящего момента и мощности от частоты вращения коленвала. Так вот, если при частоте вращения 1000 об/мин прежний двигатель ВАЗ-11189 выдавал лишь 102,5 Н·м, то новый 11182 – уже 111,4 Н·м. Этот мотор вплотную подбирается к отметке 140 Н·м уже при 2500 оборотах, тогда как предшественника для этого нужно было раскрутить до 3800 об/мин. В реальной жизни эта разница ощущается сразу – и при трогании с места, и при ускорении с относительно небольших скоростей, и при движении с полной загрузкой.
Ну а теперь давайте рассмотрим, за счет чего удалось достичь нужных показателей и какие детали затронула серьезная модернизация, потому что измененные детали непосредственно влияют на характеристики двигателя. И почти все они являются технологически и конструктивно весьма сложными.
Начнем с ГБЦ. Она претерпела очень серьезные изменения. Инженеры ВАЗа полностью поменяли рубашку охлаждения, изменили каналы впуска и выпуска и оптимизировали камеру сгорания. Как известно, камера формируется за счет головки блока и самого поршня. У 189-го мотора поршень был плоским, а камера сгорания формировалась в основном за счет головки.
Такая конфигурация была выбрана для использования шатунов длиной 133,32 мм, унифицированных с 16-клапанными моторами. Впрочем, плоский поршень не позволял реализовать потенциал двигателя по крутящему моменту из-за необходимости снижения угла опережения зажигания. Такая форма камеры сгорания имеет не самые оптимальные антидетонационные свойства, и единственный способ борьбы с этим явлением – уменьшение угла опережения зажигания.
В новом двигателе использованы более короткие, длиной 128 мм, шатуны от 1,8-литрового двигателя, а объем камеры сгорания в значительной степени формируется за счет выборки в днище поршня. Это позволило улучшить закручивание потока топливо-воздушной смеси и достичь существенно лучшего смешивания воздуха с топливом, а значит, улучшило антидетонационные свойства камеры сгорания, дало возможность использовать более оптимальные углы опережения зажигания и повысить степень сжатия с 10.3 до 10.5.
Повышение степени сжатия порождает законный вопрос: а не вызовет ли оно повышения требований к октановому числу используемого горючего, ведь чем больше степень сжатия, тем выше должны быть антидетонационные свойства топлива? Для всех производимых на АвтоВАЗе двигателей сегодня рекомендуется использовать 95-й бензин, но когда на заводе проводятся валидационные испытания, то обязательно проверяется и возможность использования 92-го бензина – можно ли его заправлять, не приведет ли это к возникновению каких-то проблем. Соответственно, в «Руководстве по эксплуатации автомобиля с двигателем 11182» есть запись о том, что в случае отсутствия 95-го бензина допускается использование 92-го. Тем не менее все официальные показатели из таблиц технических характеристик получены при использовании бензина с октановым числом 95, и чтобы полностью прочувствовать все возможности двигателя, нужно заливать именно его.
Помимо модификации камер сгорания, на двигателе ВАЗ-11182 впервые применены трехкомпонентные маслосъемные кольца вместо двухкомпонентных.
Время идет, технологии меняются, поставщики предлагают новые решения… На заводе провели испытания этих колец, и вместе с новой конструкцией маслоотделителя они показали хорошие результаты: угар масла по сравнению с предыдущим мотором упал в два раза! Угар, конечно же, зависит от нагрузок и оборотов. В ходе испытаний, например, сравнивали угар масла на 182-м и 189-м моторах при работе на 2000 оборотов. На старом моторе угар составил 9-10 г/ч, а на новом – всего 5 г/ч. И такую же картину можно видеть во всем диапазоне оборотов – угар снижен практически вдвое. Изменился и жаровой пояс: он стал шире при сохранении неизменной массы поршня. Тем самым улучшили рассеивание тепла, поступающего от камеры сгорания, при одновременном снижении температуры поршневых колец.
Итак, двигатель получил новый шатун и новый поршень. При этом поршень остался «невтыковым», то есть при обрыве ремня ГРМ не происходит утыкания поршня в клапан и загиба клапанов, поскольку на поршне есть специальные выемки под клапаны. Такие поршни теперь имеют и 16-, и 8-клапанные моторы, и ставить их начали с 2018 года. До того обрывы ремня ГРМ были реальной проблемой, а теперь, если ремень всё-таки оборвется, владельцу не придется тратить серьезные деньги на восстановление двигателя. Опять же, у многих может возникнуть вопрос: а почему применен ременный привод, а не цепной, который в теории может иметь больший ресурс?. Причина проста: он дороже в производстве. Ну а заявленный ресурс ремня ВАЗовских моторов составляет 180 000 км.
Вообще, газораспределительный механизм обновился весьма радикально. Распредвал теперь полностью новый. Его облегчили, уменьшили ширину рабочей поверхности кулачков с 15,3 до 11 мм, затылков кулачков – с 17,7 до 6 мм, поменяли профиль. На выпуске поменялась высота кулачка. Поменяли развал и фазы, и в целом массу распредвала по сравнению с предыдущей версией мотора удалось снизить примерно на 500 г, с 2650 до 2069 г. Улучшились условия подъема и посадки клапана в седло, а это снизило уровень шума – по сравнению с предыдущей версией он уменьшился на 2,4 дБ.
Клапаны тоже стали легче, поскольку диаметр штока клапана был уменьшен до 5 мм, за счет чего произошло облегчение самого клапана. Изменились и седла клапанов: если раньше толщина седла составляла 9 мм, то теперь она уменьшилась до 6 мм. Поменялся и диаметр втулок клапанов. Изменились и маслосъемные колпачки – их позаимствовали с 16-клапанного двигателя альянса Renault-Nissan.
Полностью изменилась конструкция толкателей клапанов ГРМ. Раньше там использовались две пружины и регулировочная шайба. Сейчас там одна пружина и толкатель без регулировочной шайбы, так что при регулировке клапанов меняются сами толкатели. Такое решение используется как в моторах альянса Renault-Nissan, так и у многих других конкурентов, например, в двигателях Hyundai и Kia. В результате клапаны начинают требовать регулировки только при пробеге в 90 000 км. Это хорошая цифра, но главное, что такая конструкция позволила отказаться от нулевого ТО и первой регулировки на 2000 км пробега. Правда, теперь процедура регулировки заключается в замене толкателей, что более трудоемко.
Радикально поменялась технология сборки. Раньше на заводе собирали головку цилиндров отдельно от двигателя, и на ней же происходила регулировка клапанов. Собранная головка ставилась на двигатель, и затягивались винты крепления головки. В процессе затяжки винтов происходила небольшая деформация головки, нарушающая регулировку зазоров клапанов, и в итоге при пробеге в 2 тысячи км клапаны приходилось обязательно регулировать. Сейчас сборка осуществляется на двигателе: сначала головку ставят на двигатель, потом собирают, затем регулируют, и этим обеспечивается точность зазоров между толкателями и кулачками.
Поменяли и верхнюю крышку двигателя: теперь она выполнена из алюминия, имеет 6 точек крепления вместо двух и снабжена новой прокладкой для надежного уплотнения крышки головки цилиндров. Изменили конструкцию маслоотделителя, и это позволило лучше отделять масло от картерных газов, поступающих после отделения масла обратно в двигатель.
Качество отделения масла повысилось в 2 раза: если на предыдущем двигателе уходило порядка 2 г/ч, то сейчас – меньше 1 г/ч. Собственно, у восьмиклапанника и не было особых проблем с расходом масла, но новые технологии позволили сделать эту ситуацию еще лучше.
Конструкторы уменьшили диаметр дроссельного патрубка, получив за счет этого возможность точнее дозировать поступление воздуха при низких оборотах. Это позволило снизить обороты холостого хода с 850 до 750 об/мин, и это очень важно для потребителя, поскольку этот показатель непосредственно влияет на расход топлива. Заодно можно ожидать, что владельцы автомобилей с новым мотором забудут о такой характерной для восьмиклапанных двигателей болячке, как проблема плавающих оборотов.
Блок цилиндров остался без изменений – конфигурации масляных каналов и каналов охлаждения менялись только в головке, а вот конструкция коленчатого вала была модифицирована более чем существенно. Ширина шатунных шеек была уменьшена с 27,2 до 19 мм, а их диаметр – с 47,8 до 43 мм. Уменьшено количество противовесов: на старом восьмиклапаннике их было 8, а стало 4 (такое решение также используется на моторах Renault).
Изменилась схема подачи масла на подшипники скольжения. Технологи существенно оптимизировали производственный процесс: раньше сверление масляных каналов проходило в три этапа: сверлили шатунные шейки в одном сечении, сверлили коренные шейки, а потом сверлили диагональный канал сквозь коренную и шатунную шейку и ставили заглушки. Теперь сверлится один диагональный канал с поверхности коренной в шатунную шейку с выходом на её поверхность, что позволило отказаться от заглушек и получать канал одним сверлением. Это никак не отразилось на качестве смазывания, зато не только уменьшило себестоимость изготовления детали, но и улучшило эпюру несущей способности масляного клина в подшипниках скольжения.
Кроме того, оптимизированы прокладка головки цилиндров, свечи зажигания, катколлектор, корпус рампы форсунок и многое другое.
..
Ну а что же в итоге? В итоге в линейке двигателей ВАЗ появился достаточно современный по конструкции, тяговитый и, что важно, относительно недорогой двигатель. На сегодняшний день он сертифицирован по нормам Евро-5+, но экологические нормы неминуемо будут ужесточаться, и у двигателя есть потенциал повышения до Евро-6, да и в целом потенциал его модернизации еще не исчерпан. В любом случае, в течение ближайших 5-6 лет он точно будет пользоваться спросом.
Опрос
Вы бы взяли скорее 8- или 16-клапанный мотор себе, если бы выбирали новый Ларгус?
Всего голосов:
Воронежскому экс-судье Евгению Капустину удалось избежать наказания за резонансное ДТП
Главная / Контекст / Воронежскому экс-судье Евгению Капустину удалось избежать наказания за резонансное ДТП
Воронеж. 05.04.2021. ABIREG.RU – Бывший судья Лискинского районного суда Воронежской области Евгений Капустин избежал ответственности за совершенное в 2018 году ДТП в связи с истечением сроков давности. Об этом со ссылкой на региональное СУ СК сообщает издание «Вести Воронеж».
Напомним, господина Капустина обвиняли в совершении преступления, предусмотренного ч. 1 ст. 264 УК РФ («Нарушение правил дорожного движения и эксплуатации транспортных средств»). Осенью прошлого года экс-судья направил ходатайство о прекращении уголовного дела в связи с истечением срока давности после ознакомления с материалами. 30 октября 2020 года следователь вынес соответствующее постановление. В ведомстве уточняли, что прокуратура Воронежской области по результатам изучения решения регионального СК признала его законным и обоснованным.
Добавим, изначально дело поступило в Лискинский районный суд в сентябре 2020 года, однако позже облсуд решил передать его в Бобровский райсуд из-за возможного конфликта интересов. Это решение было принято из-за того, что Евгений Капустин является бывшим судьей Лискинского райсуда.
В основу уголовного дела легла авария, случившаяся в Лисках 17 октября 2018 года. Тогда внедорожник Toyota RAV4 господина Капустина врезался на перекрестке улиц Солнечная и Домостроителей в автомобиль Lada Granta, за рулем которого находился таксист Александр Юраков. В результате столкновения тяжкий вред здоровью был нанесен водителю и пассажиру отечественного транспортного средства.
По версии следствия, после ДТП Евгений Капустин не вызвал бригаду скорой помощи и не оповестил о случившейся аварии сотрудников полиции. На тот момент судья якобы скрылся с места происшествия, не узнав, в каком состоянии находятся пассажиры другого автомобиля. Брошенный господином Капустиным внедорожник стоял неподалеку от места аварии около двух часов, после чего к Toyota RAV4 направились сотрудники полиции для осмотра транспортного средства. Во время того как один из экспертов снимал отпечатки пальцев в салоне иномарки, машина загорелась. Сотрудник полиции успел выбежать и забрать с собой криминалистическое оборудование.
В ходе дальнейших разбирательств следователи выяснили, что поджог по просьбе виновника ДТП Евгения Капустина мог произвести бывший инспектор ГИБДД Руслан Белоконев. В отношении полицейского было возбуждено уголовное дело по ч. 3 ст. 294 УК РФ («Воспрепятствование осуществлению правосудия и производству предварительного расследования, совершенное лицом с использованием своего служебного положения»). В конце февраля 2021 года Бобровский районный суд Воронежской области оправдал господина Белоконева в связи с непричастностью к преступлению.
Фото «Подслушано Лиски»
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie.
Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie. - Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo
Конструирование плазмиды
Комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая mTurquoise, и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart 43 . кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены с помощью сайт-специфического мутагенеза с помощью ПЦР. Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) 43 и K206A (для Turquoise2-GL).Прототип ERK-биосенсора активности FRET, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно 19 . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP. Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan).Точно так же CFP в PicchuEV-x 19,44,45 и RaichuEV-Ras 19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 для образования hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно. В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов.Варианты NanoLuc hyBRET-ERK также были получены реакцией In-Fusion. CeNL, гибридный белок Turquoise2 и NanoLuc, был описан ранее 22 . Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно.
. кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS 47 или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) 48 .Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки компонентов, кодирующих кДНК hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (геном устойчивости к бластицидину) и кодон-оптимизированным YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP 49 . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK заменяли на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК.Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена в вектор CSII-EF с IRES-puro, а кДНК для голубого нано-фонаря и желтого нано-фонаря были амплифицированы с помощью ПЦР и субклонированы в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов. pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее 50 . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion.Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548-1020) или интер-Sh3-доменом p85 человека (aa 428-621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 51 . Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена перед последовательностью поли А.Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.
Клеточная культура и создание стабильных клеточных линий
Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония). Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония).Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 на воздухе при 37 ° C. Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase 48 , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute.Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем дополнительно культивировали в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T котрансфицировали вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида # 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком доктора. Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Уоррингтон, Пенсильвания).Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.
Реагенты
Диацетилцелентеразин-h синтезировали, как описано ранее 14 . Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония).Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и эпидермальный фактор роста были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использован для липофекции плазмиды в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина. Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.
Спектроскопия
Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор помещали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock). YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus).Спектры флуоресценции регистрировали с интервалом 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12. Полученные спектры флуоресценции и люминесценции были использованы для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.
Оценка эффективности передачи энергии
Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны к теоретическим спектрам излучения, по существу, как сообщалось ранее 20 . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон). Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:
$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$
(1)
где F ( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε c ( λ из ) — коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E CY — КПД FRET между CFP и YFP, ϕ C — квантовая эффективность CFP, f C ( λ ) — нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ Y — квантовая эффективность YFP, f Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε Y ( λ из ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения.Модель ε Y ( λ из ) значение при 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε Y ( λ из ) значение при 513 нм.
Предполагая, что внутрикадровое слияние RLuc8 на С-конце не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:
$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} — {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$
(2)
где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E RC — это эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E RY — это эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ R — квантовая эффективность RLuc8, а f R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.
E CY был оценен путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к формуле. 1. E RC Предполагается, что является постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ CNL , выражается следующим уравнением:
$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$
(3)
Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E RC было определено как 0,13. Наконец, E RY был оценен путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.2. Значения ε и ϕ перечислены в Таблице S1.
Скорость передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.
$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$
(4)
где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E NC — это эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E NY — это эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ N — квантовая эффективность NanoLuc, а f N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc.Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E NC , был также оценен по формуле. 4, установка E NY и E CY как ноль.
Покадровая визуализация культивируемых клеток
Покадровые изображения были получены и обработаны с использованием, по существу, тех же условий и процедур, что и ранее. 52 .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом в процессе покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см 2 в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить рассеянный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25×36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Для визуализации BRET не использовалось дихроичное зеркало.
Обработка изображений
Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума 53 . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.
Optogenetics
Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать мембранную транслокацию слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом 490 нм (55 мкВт / см 2 ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см 2 ) или светом 490 нм (180 мкВт / см 2 ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).
Анализы на микропланшетном ридере
Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разведенным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью устройства для считывания микропланшетов GloMax Discover (Promega).Фильтр короткого прохода 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $$
(5)
Здесь SD — это стандартное отклонение, а Ave — это среднее значение желтого / голубого люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее 26 . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$
(7)
Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK — это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.
Образование опухоли ксенотрансплантатом и генерация трансгенных мышей
Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 6 клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мыши были визуализированы через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 5 клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенные мыши были получены с помощью Tol2-опосредованного переноса гена 54 . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.
Биолюминесцентная визуализация всего тела животных
Для сравнения продолжительности жизни биолюминесценции между аналогами целентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для получения люминесцентных изображений мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. / Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время воздействия 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.
Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши
Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому вентилятору MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%. Чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием, обнаженную область левого легкого осторожно отсосали и зафиксировали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был подключен к вакуумному насосу. Опухоли в легких получали с помощью вертикального микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного водно-иммерсионным объективом XLPlanN 25x (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. В качестве дихроичных зеркал использовали DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Используемые фильтры выбросов: FF01-425 / 30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET, соответственно. Во время визуализации FRET мышам внутривенно вводили 5,0 мг / кг -1 PD-0325901 без прерывания визуализации.
Комбинированное исследование одномолекулярной FRET и триптофановой флуоресценции сворачивания РНКазы H в кислых условиях
Abstract
Используя одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET), мы исследовали РНКазу H в присутствии денатуранта гуанидинхлорида. изучить его хорошо известную складку промежуточного звена.Гистограммы эффективности FRET были определены в экспериментах на свободно диффундирующих белках при pH 3. Даже с превосходной статистикой данных промежуточное соединение сворачивания не очевидно из гистограмм эффективности FRET из-за широких и перекрывающихся распределений, связанных с каждым из трех макроскопических (свернутых, промежуточные, развернутые) состояния. Мы разработали процедуру глобального подбора для данных smFRET, основанную на термодинамической модели, которая предполагает, что свободные энергии трех состояний изменяются линейно в зависимости от активности денатуранта.Кроме того, мы включили данные о выбросах триптофана, измеренные на объемных образцах, которые накладывают существенные ограничения на относительную популяцию трех состояний. Анализ дает различия в свободной энергии между состояниями и, таким образом, фракционные населенности во всем диапазоне концентраций денатуранта.
Графический аннотация
Основанный на модели глобальный анализ данных флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул FRET и триптофана позволяет изучать сворачивание РНКазы H, pH 3,0, в зависимости от концентрации химического денатуранта GdmCl.
- Загрузить: Загрузить полноразмерное изображение
Основные моменты
► Глобальный анализ данных smFRET и триптофана флуоресценции РНКазы H. ► Анализ дает убедительные результаты, несмотря на сильно перекрывающиеся распределения FRET. ► Промежуточный продукт сворачивания РНКазы H расщепляется в дестабилизирующих условиях при pH 3
Ключевые слова
Сворачивание белка
РНКаза H
Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул (smFRET)
Флуоресценция триптофана
Складные промежуточные продукты
Рекомендуемые статьи )
Просмотреть полный текстCopyright © 2011 Elsevier B.V. Все права защищены.
Рекомендуемые статьи
Цитирующие статьи
Межбазовый FRET в РНК: от А до Я | Исследование нуклеиновых кислот
Абстрактные
Interbase FRET может предоставить очень подробную информацию о расстоянии, ориентации и динамике нуклеиновых кислот, дополняя существующие методы структуры и динамики. Здесь мы сообщаем о первой паре аналогов основания РНК FRET, состоящей из донора tC O и неэмиссионного акцептора tC nitro .Акцепторный рибонуклеозид здесь синтезирован и впервые включен в РНК. Эта пара FRET точно сообщает среднюю структуру РНК A-формы, и ее полезность для исследования структурных изменений РНК демонстрируется путем мониторинга перехода от A- к Z-форме РНК. Наконец, измеренные данные FRET сравнивали с теоретическими паттернами FRET, полученными из двух ранее описанных структур Z-RNA PDB, чтобы пролить новый свет на эту неуловимую конформацию РНК.
ВВЕДЕНИЕ
Биологические роли различных РНК жизненно важны и разнообразны и включают кодирование, регуляцию и экспрессию генов, а также катализ.Это отражает важность вторичной и третичной структуры и динамики для их функции, что подчеркивает необходимость разработки инструментов, которые могут исследовать такие параметры (1). Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это процесс, в котором энергия передается без излучения между донорным и акцепторным хромофором. Эффективность этого процесса сильно зависит как от расстояния, так и от ориентации между хромофорами; следовательно, может быть получена информация о структуре и / или относительном положении различных меченных донорами и акцепторами биомолекул в физиологических условиях in vitro, или даже в живых клетках (2, 3).FRET особенно ценен для изучения больших и гибких структур, таких как РНК и комплексы РНК-белок, которые трудно поддаются традиционным методам высокого разрешения, таким как ЯМР и рентгеновская кристаллография (4). Этот метод также можно использовать для получения более подробной информации о структуре и динамике, например, путем объединения измерений FRET одиночных молекул с подробным анализом и моделированием (5).
На сегодняшний день внешние хромофоры с (предположительно) случайной ориентацией использовались в большинстве исследований FRET для определения совместной локализации и расстояний, что означает, что используется только зависимость от расстояния.Например, индуцированное ионами сворачивание изгибов в РНК было исследовано с использованием мечения концов флуоресцеином и Cy3 (6). Одним из способов повышения уровня информации, получаемой от FRET в системах РНК, могло бы быть использование аналогов флуоресцентных оснований, которые прочно расположены внутри нуклеиновой кислоты и, следовательно, сообщают как о расстоянии, так и об относительной ориентации между донором и акцептором. Было показано, что это позволяет с высокой точностью исследовать структурные изменения в ДНК (7,8). До сих пор сообщалось об ограниченном количестве FBA для РНК, например.грамм. tC O (9), тиено [3,4- d ] пиримидины ( th A, th C, th G и th U) (10) и изотиазоло [4,3 — d ] пиримидинов ( tz A, tz C, tz G и tz U) (11), суррогат U, применяемый в исследованиях связывания малых молекул РНК (12), аналог пиримидина для G-квадруплексные исследования (13) и нуклеозиды расширенной РНК (кРНК) (14). Однако межосновный FRET был исследован только для ДНК с использованием либо неэмиссионного акцептора (FRET-пары tC O –tC nitro (15), qAN1 – qA nitro (8) и pA – qA nitro ). (16)) или эмиссионного акцептора ( th dG – tC) (17).Использование эмиссионного акцептора теоретически может обеспечить простое колориметрическое считывание и простой и полезный внутренний контроль эффективности FRET при условии, что полосы эмиссии донора и акцептора существенно разделены. Однако большинство FBA с высокой эмиссией излучают в довольно узком диапазоне длин волн (400–500 нм), и результирующее перекрытие эмиссии может добавить дополнительный уровень сложности и неопределенности к анализу FRET. Напротив, неэмиссионный акцептор позволяет количественно оценить эффективность FRET просто как уменьшение флуоресценции (или времени жизни) донора по сравнению с флуоресценцией одного донора, что значительно упрощает анализ данных и повышает точность.
Здесь мы сообщаем о первых исследованиях межосновного FRET в РНК с использованием пары FRET tC O –tC nitro (Рисунок 1). Неэмиссионная акцепторная молекула tC nitro синтезирована и впервые охарактеризована для использования в контексте РНК. В сравнительном исследовании мы видим отличное соответствие между наблюдаемыми и теоретически предсказанными значениями эффективности FRET для РНК А-формы без существенных признаков структурных нарушений по сравнению с дуплексом РНК естественной формы А, что указывает на то, что эту пару FRET можно использовать для исследования структурные изменения внутри РНК с высокой точностью.Более того, общее использование межосновного FRET для исследования структурных изменений в РНК продемонстрировано здесь с использованием конформационного изменения от A- к Z-форме.
Рисунок 1.
Структура эмиссионного донора FRET tC O и неэмиссионного акцептора FRET tC nitro .
Рисунок 1.
Структура эмиссионного донора FRET tC O и неэмиссионного акцептора FRET tC nitro .
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Синтез и характеристика фосфорамидита рибо-tC нитро представлены в дополнительных данных.Фосфорамидит рибо-tC O был синтезирован согласно литературным данным (9). Твердофазный синтез tC O / tC нитро -модифицированных олигорибонуклеотидов и их характеристики описаны в дополнительных данных.
Все использованные образцы, если не указано иное, были приготовлены в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,4, с добавлением 100 мМ NaCl и 1 мМ EDTA. Все образцы были смешаны и обработаны в стерильной среде, свободной от РНКазы. Концентрацию олигонуклеотида определяли путем измерения поглощения при 260 нм.Молярную поглощающую способность немодифицированных одиночных цепей олигонуклеотидов при 260 нм рассчитывали с использованием онлайн-анализатора олигонуклеотидов IDT (Integrated DNA Technologies; http://eu.idtdna.com/calc/analyzer). Молярная абсорбционная способность модифицированных цепей была рассчитана таким же образом с заменой модифицированного основания на цитозин и с поправкой на разницу молярной абсорбции между цитозином (ϵ = 7400 M -1 см -1 ) и tC O ( ϵ = 11000 M −1 см −1 ) или tC nitro (ϵ = 9700 M −1 см −1 ) на длине волны 260 нм.
Гибридизация образцов РНК А-формы, используемых для УФ-плавления и кругового дихроизма, была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи с равным количеством акцепторной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагреванием до 95 ° C и, через 10 мин, охлаждение до 5 ° C при 7,5 ° C h −1 . Концентрация донорных нитей при отжиге составляла 4 мкМ. Образцы РНК в форме A – Z, используемые для УФ-плавления и кругового дихроизма, были приготовлены аналогичным образом, за исключением того, что каждую донорную цепь смешивали с 30% избытком ее комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и что концентрация доноров при отжиге составляла 5.08 мкМ.
Образцы для эталонного исследования A-РНК FRET были гибридизованы, как указано выше, с 30% избытком его комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и концентрацией донорной цепи 2 мкМ во время отжига.
Гибридизация образцов для исследования FRET от A- до Z-РНК была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи со 100% избытком ее комплементарной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагреванием до 75 ° C и, через 10 мин, охлаждением. до 55 ° C при 1,7 ° C h -1 с последующим охлаждением до 5 ° C при 60 ° C h -1 .Концентрация донорной нити во время отжига составляла 20 мкМ (была выбрана более высокая концентрация, чтобы способствовать гетеродуплексному отжигу по сравнению с самоотжигом в шпильки).
Все образцы, использованные для измерения РНК A-формы, были впоследствии разбавлены до 2 мкМ фосфатным буфером, тогда как образцы Z-формы были разбавлены фосфатным буфером и достаточным количеством NaClO 4 · H 2 O (Sigma-Aldrich) для получения результата. в желаемой концентрации NaClO 4 (8 M, если не указано иное), принимая во внимание результирующее изменение плотности раствора (18), а также корректируя разницу в концентрации образца (определяемую поглощением при 260 нм) .
Все образцы измеряли сразу после отжига или хранили при -20 ° C между измерениями.
РНК УФ-плавление и круговой дихроизм
Кривые плавленияРНК в УФ-диапазоне регистрировали на приборе Cary 4000 (Varian Technologies) с программируемым многоячеечным температурным блоком при нагревании от 20 ° C до 90 ° C и последующем охлаждении до 20 ° C со скоростью 0,5 ° C мин. -1 . Поглощение при 260 нм регистрировали каждые 0,5 ° C в течение двух циклов. Концентрация дуплекса во всех измерениях составляла 2 мкМ.Температуры плавления рассчитывались как максимум первой производной кривых плавления в УФ-диапазоне после сглаживания с помощью FFT-фильтрации.
Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировали на спектрометре КД Chirascan (Applied Photophysics), сканирование которого составляло от 200 до 600 нм, с использованием времени интегрирования 0,5 с и трех повторов. Концентрация дуплекса составляла 2 мкМ, и все спектры корректировались на фоновый вклад.
Измерения флуоресценции
Спектры стационарного излучения регистрировали на SPEX Fluorolog 3 (Jobin Yvon Horiba) с длиной волны возбуждения 377 нм.Концентрация дуплекса во всех образцах составляла 2 мкМ в стационарном режиме и при измерении срока службы. Эмиссия регистрировалась между 385 и 745 нм при скорости сканирования 600 нм мин -1 .
Квантовые выходы были измерены для дуплексов только с tC O (т.е. без tC nitro ) с длиной волны возбуждения 356 нм с использованием сульфата хинина (Φ f = 54,6%) в 0,5 MH 2 SO 4 в качестве справки. Эмиссия регистрировалась в диапазоне от 360 до 690 нм при скорости сканирования 600 нм мин -1 .
Время жизни флуоресценции определяли с помощью коррелированного по времени подсчета одиночных фотонов (TCSPC). Образцы возбуждали импульсным лазерным диодом PicoQuant (10 МГц), излучающим на длине волны 377 нм, а эмиссионный монохроматор был установлен на 460 нм. Подсчет проводился с помощью фотоумножителя с микроканальной пластиной R3809U-50 (Hamamatsu) и вводился в многоканальный анализатор Lifespec (Edinburgh Analytical Instruments) с 2048 каналами. Условие остановки было установлено на 10 000 отсчетов в верхнем канале. Реконволюционная подгонка к двух- или трехэкспоненциальным функциям выполнялась с помощью Fluofit Pro v.4 (PicoQuant GmbH). Средние времена жизни были взвешены по амплитуде в соответствии с уравнением (1):$$ \ begin {уравнение *} \ langle \ tau \ rangle = \ frac {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i} {\ tau _i}} } {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i}}} \ end {формула *} $$
(1) где | $ \ langle \ tau \ rangle $ | — среднее время жизни, | $ {\ tau _i} $ | — время жизни i и | $ {\ alpha _i} $ | — амплитуда и -го времени жизни. Измерения были продублированы. Эффективность FRET рассчитывалась исходя из времени жизни стационарного излучения и флуоресценции в соответствии с уравнениями (2 и 3):$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{I _ {{\ rm DA }}}}} {{{I _ {\ rm D}}}} \ end {уравнение *} $$
(2)$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{\ tau _ {{\ rm DA}}}}} {{{\ tau _ {\ rm D}}}} \ end {формула *} $$
(3) где I — интегральная интенсивность донора, а τ — среднее время жизни донора.6}} \ end {уравнение *} $$ (5) где η — показатель преломления среды (1,4 для биомолекул), Φ D — квантовый выход донора, Дж ( λ ) — интеграл перекрытия, R DA — расстояние между донором и акцептором, а κ 2 — коэффициент ориентации, описывающий относительную ориентацию дипольных моментов перехода донора и акцептора. Зная фотофизические свойства пары FRET (Φ D и J ( λ )) и относительное положение и ориентацию донора и акцептора ( R DA и κ 2 ), Ожидаемая эффективность переноса рассчитывалась с помощью программы FRETmatrix на основе MATLAB (19).Протокол немного отличался для A- и Z-формы РНК (рис. 2A), как описано ниже.Рисунок 2.
( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот. Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).
Рисунок 2.
( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот.Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).
А-форма
Средние базовые параметры ступени для А-формы были взяты из Olson et al. (21) На рис. {\ rm {4}}} {\ rm {d}} \ lambda \ end {формула *} $$ (6) где I D — это спектр излучения донора, зависящий от длины волны, нормированный для интегрирования к единице, A — зависящая от длины волны молярная поглощающая способность акцептора, а λ — длина волны в нм.Z-образная форма
Для обеспечения возможности сравнения между тремя ранее описанными структурами Z-формы (1T4X, 2GBX и 1QBJ), которые являются 6-мерными, и нашей структурой, которая представляет собой 14-мерную структуру, мы использовали метод, в котором мы расширили 6меров ранее описанных PDB- файлы на 14меров с использованием усредненных параметров базового шага. PDB-файлы сначала были проанализированы с помощью Web 3DNA для получения параметров базового шага для каждой структуры (24). Каждый параметр был усреднен для создания усредненных параметров базового шага GC и CG для конкретной структуры.Используя эти параметры, для каждой структуры был создан новый файл базовых шагов, содержащий 14 вместо исходных 6 базовых пар. Наконец, с использованием этих файлов базовых шагов, стандартной геометрии пар оснований Уотсона-Крика, квантового выхода tC O в Z-РНК (Φ f = 21,3%) и спектрального перекрытия между эмиссией tC O и абсорбция tC нитро в Z-РНК ( J DA = 1,4 × 10 14 нм 4 M -1 см -1 ), теоретическая эффективность FRET при различных разделениях для каждой структуры рассчитывались с помощью FRETmatrix (19).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез tC
нитроМы недавно сообщили о синтезе и включении в РНК трибонуклеозида tC O и пришли к выводу, что рибо-tC O сохраняет дуплекс A-формы, поддерживает высокий квантовый выход независимо от контекста последовательности и, следовательно, является отличным FRET. кандидат в доноры для межосновного FRET в РНК (9). В данной работе мы сообщаем о синтезе неэмиссионного акцептора FRET tC нитро -рибонуклеозида и его фосфорамидитного субстрата 5 (схема 1).2′-O-TBS-защищенный рибонуклеозид tC nitro ( 4 , схема 1) был синтезирован в масштабе нескольких граммов по пятиэтапному протоколу. Силильная защитная группа соединения 1 , включая защиту 2′-OH TBS, необходимую для конечного строительного блока, была введена на первом этапе на основе ранее опубликованной методологии (25). Соединение 1 затем подвергали кросс-сочетанию CS-катализатора с тиолом 2 , что позволило селективно формировать связь CS при сохранении защитных групп и стереохимии нуклеозидного фрагмента с получением соединения 3 в Доходность 81%.Трициклическая ароматическая система tC nitro была сконструирована с конденсацией с замыканием цикла, для которой PyBOP оказался уникально активным. В мягких условиях продукт внутримолекулярной конденсации был получен с высокой селективностью по межмолекулярной реакции. В результате с полученного полностью защищенного нитро рибонуклеозида tC была снята защита с получением соединения 4 . Две стандартные стадии защиты (26,27) дали желаемый строительный блок tC нитро -фосфорамидита 5 для включения олигорибонуклеотида.
Схема 1.
Синтез tC нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu 2 Si (OTf) 2 , DMF, 0 ° C, 1 ч; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH 2 NH 2 (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs 2 CO 3 , ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч.( E ) Py · (HF) x , CH 2 Cl 2 , 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.
Схема 1.
Синтез tC нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu 2 Si (OTf) 2 , DMF, 0 ° C, 1 ч; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH 2 NH 2 (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs 2 CO 3 , ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч. ( E ) Py · (HF) x , CH 2 Cl 2 , 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.
Тест FRET А-формы РНК
Для изучения FRET в РНК с использованием tC O и tC nitro , мы синтезировали три донорные последовательности, содержащие tC O и четыре комплементарных акцепторных последовательности, содержащие tC nitro (рис. 3A), а также их немодифицированные аналоги, названные D0 и A0 соответственно.Эти нити позволяют образовывать дуплексы с 2–13 п.н., разделяющими донор и акцептор. Спектры КД дуплексов, модифицированных tC nitro , очень похожи на спектры соответствующего немодифицированного дуплекса, что указывает на то, что tC nitro не нарушает A-форму (дополнительный рисунок S1). Кроме того, свойства УФ-плавления дуплексов, модифицированных tC nitro , показывают, что tC nitro , как и tC O , оказывает немного стабилизирующее действие на A-форму РНК, причем степень стабилизации зависит от ближайших соседей (1 .4–1,7 ° C для 5′-C tC нитро U-3 ‘; 3,9–4,2 ° C для 5’-U tC нитро C-3 ‘; Дополнительная таблица S1) (9).
Рисунок 3. Последовательности
( A ) РНК, используемые для исследования характеристик межосновного FRET в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донорсодержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазовые сайты обозначены нижним подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, используемых в этом исследовании, см. В дополнительных таблицах S1 и S7.
Рисунок 3. Последовательности
( A ) РНК, используемые для исследования характеристик межосновного FRET в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донорсодержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазовые сайты обозначены нижним подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, используемых в этом исследовании, см. В дополнительных таблицах S1 и S7.
Флуоресцентные свойства tC O и tC nitro в A-форме РНК суммированы в таблице 1. Важно отметить, что tC O сохраняет высокий и стабильный квантовый выход флуоресценции независимо от контекста последовательности (9), а также представляет собой отличное перекрытие между длинноволновой полосой излучения tC O и полосой поглощения tC nitro (рис. 4).Предполагая свободное вращение дипольных моментов перехода (κ 2 = 2/3), теоретическое расстояние Фёрстера для пары tC O –tC нитро FRET в РНК составляет 28 Å, что соответствует почти одному полному обороту спираль А-формы РНК.
Таблица 1.Абсорбционные и флуоресцентные свойства tC O и tC nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК
| . | λ абс., Макс. [нм] . | ϵ макс. [M −1 см −1 ] . | λ em, макс. [нм] . | Φ f [%] . | 〈τ〉 [нс] . |
|---|---|---|---|---|---|
| tC Oa | 368–373 (370) | 7400–9700 (8300) | 452–460 (456) | 20–25 (22) | 3,8–4,7 (4,3) |
| tC нитро b | 449–458 (454) | 6400–7100 (6800) | — | — |
| 22 | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| λ абс., Макс. [нм] . | ϵ макс. [M −1 см −1 ] . | λ em, макс. [нм] . | Φ f [%] . | 〈τ〉 [нс] . | |
| tC Oa | 368–373 (370) | 7400–9700 (8300) | 452–460 (456) | 20–25 (22) | 3.8–4.7 (4,3) |
| tC nitro b | 449–458 (454) | 6400–7100 (6800) | — | — |
Поглощающий флуоресцентные свойства tC O и tC nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК
| . | λ абс., Макс. [нм] . | ϵ макс. [M −1 см −1 ] . | λ em, макс. [нм] . | Φ f [%] . | 〈τ〉 [нс] . |
|---|---|---|---|---|---|
| tC Oa | 368–373 (370) | 7400–9700 (8300) | 452–460 (456) | 20–25 (22) | 3,8–4,7 (4,3) |
| tC нитро b | 449–458 (454) | 6400–7100 (6800) | — | — |
| 22 | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| λ абс., Макс. [нм] . | ϵ макс. [M −1 см −1 ] . | λ em, макс. [нм] . | Φ f [%] . | 〈τ〉 [нс] . | |
| tC Oa | 368–373 (370) | 7400–9700 (8300) | 452–460 (456) | 20–25 (22) | 3.8–4.7 (4,3) |
| tC нитро b | 449–458 (454) | 6400–7100 (6800) | – | – |
Рис. 4.
Спектральное перекрытие между испусканием tC O и поглощением tC nitro в A-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + .
Рис. 4.
Спектральное перекрытие между испусканием tC O и поглощением tC нитро в А-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + .
Чтобы исследовать применимость межосновного FRET с использованием tC O и tC nitro в РНК-системах, измеренная эффективность FRET сравнивалась с теоретическим значением для A-формы РНК, которое было рассчитано на основе установленной структуры РНК и свойств зонда.Для сравнения также были рассчитаны теоретические значения, основанные на B-форме РНК. В этом исследовании эффективность FRET как функция расстояния донор-акцептор была измерена с использованием измерений стационарного излучения и времени жизни флуоресценции tC O в дуплексах с tC nitro и без него (дополнительные таблицы S2 и S3; дополнительный рисунок S2). На рис. 5 показана средняя эффективность переноса этих двух методов вместе с теоретической эффективностью FRET для tC O –tC nitro внутри статической A-формы и B-формы нуклеиновой кислоты.Пунктирные кривые, показывающие эффективность переноса также при неестественном нецелочисленном разделении, добавлены к рисунку для направления взгляда. Локальные минимумы этих кривых происходят от разделений, где диполи перехода донора и акцептора должны быть перпендикулярны друг другу и, следовательно, составляют геометрию, в которой передача энергии не может происходить в этом статическом теоретическом представлении структуры нуклеиновой кислоты.
Рисунок 5.
Эффективность FRET между tC O и tC nitro в А-форме РНК как функция разделения пар оснований.Голубые ромбы обозначают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение всего срока службы. Черными ромбиками отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC O –tC nitro внутри А-формы РНК, а пунктирной кривой показана прогнозируемая эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC O –tC nitro внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7.4, 123 мМ Na + .
Рис. 5.
Эффективность FRET между tC O и tC nitro в А-форме РНК как функция разделения пар оснований. Голубые ромбы обозначают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение всего срока службы. Черными ромбиками отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC O –tC nitro внутри А-формы РНК, а пунктирной кривой показана прогнозируемая эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC O –tC nitro внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях.Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + .
Измеренные данные точно соответствуют предсказанному паттерну FRET А-формы, показывая, что аналоги оснований прочно укладываются внутри РНК, и настоятельно предполагают, что они не вызывают значительного возмущения структуры РНК. Таким образом, это эталонное исследование показывает, что пара tC O –tC nitro FRET отлично подходит для измерения межосновного FRET в РНК, особенно при разделении 4–12 п.н. Ранее мы показали, как связывание нетропсина с ДНК и переход от B к Z в ДНК можно изучать с помощью межосновного FRET (7,8).Поскольку фотофизические свойства tC O и tC nitro хорошо известны (см. Таблицу 1 выше), аналогичные исследования внутри РНК теперь должны быть возможны, что делает межосновной FRET с использованием tC O –tC nitro мощным дополнением к существующие методы изучения структуры РНК, конформационных изменений и динамики.
От A до Z-формы FRET
Чтобы проиллюстрировать потенциал этого метода, мы разработали исследование, в котором tC O –tC нитро межосновной FRET применяли для исследования конформационных изменений в РНК, в данном случае перехода от A- к Z-RNA.Структура правой B-формы ДНК и A-формы РНК хорошо охарактеризована. Однако и ДНК, и РНК также могут принимать левую структуру, называемую Z-формой. Z-форма ДНК была впервые кристаллизована и охарактеризована с помощью рентгеновской кристаллографии в 1979 г. (28), тогда как первая левосторонняя структура РНК была описана в 1984 г. (29). Как и в случае с Z-формой ДНК, переход от A- к Z-форме РНК происходит предпочтительно в чередующихся GC-повторах, но для индукции трансформации необходимы более экстремальные солевые условия.Биологическая роль Z-формы РНК до сих пор неясна, но окрашивание антителами к Z-РНК указывает на ее присутствие в цитоплазме и ядрышке (30), а некоторые белки интерферонового ответа имеют домены, которые могут стабилизировать Z-форму РНК (31). Однако не хватает инструментов, которые могли бы контролировать структурные изменения Z-РНК в системах живых клеток, а структурные исследования Z-РНК немногочисленны; только две 6-мерные структуры были представлены в базе данных PDB: исследование ЯМР, где Z-форма индуцируется высокой концентрацией соли (6 M NaClO 4 , PDB ID: 1T4X), и кристаллографическое исследование Z-формы РНК вместе с фермент ADAR1 (PDB ID: 2GXB) (31,32).
Чтобы сравнить структуры, депонированные в PDB, и структуры, использованные в этом исследовании, мы применили теорию FRET для прогнозирования паттернов FRET, ожидаемых от tC O –tC nitro при вставке в разные положения в два олигорибонуклеотида, каждый из которых имеет структура, соответствующая одной из упомянутых выше записей PDB (рисунок 6A). Поскольку некоторые исследования указывают на сильное сходство между Z-формой ДНК и РНК, теоретический паттерн FRET, полученный с использованием структуры Z-формы ДНК, связанной с ADAR1 (PDB ID: 1QBJ), был включен в качестве дополнительного сравнения (31,33).Как видно на рисунке 6A, теоретический паттерн FRET для трех указанных структур демонстрирует общее сходство, но также и значительные различия из-за структурных различий между ними. Поскольку Z-форма в основном встречается в GC-повторах, наши аналоги цитозина предоставляют прекрасную возможность изучить конформационные изменения от A- к Z-форме РНК. Наша цель в этом исследовании РНК из A- в Z-формы была двоякой: во-первых, установить, можно ли использовать FRET между основаниями для исследования перехода РНК из A- в Z.Это конформационное изменение обычно контролируется с помощью CD, для чего требуются приборы, которые реже используются в научно-исследовательских лабораториях, значительно более высокие количества образцов, чем при измерениях флуоресценции, и несовместимы с измерениями в целлюлозе . Во-вторых, чтобы получить новую структурную информацию о Z-РНК и поместить ее в контекст ранее определенных структур Z-РНК.
Рисунок 6.
( A ) Измеренная эффективность FRET между tC O и tC nitro для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее сообщенных структур Z-формы. : Записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO 4 ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z -форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33).( B ) Измерена эффективность FRET между tC O и tC nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO 4 (Z-форма), и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение срока службы.
Рисунок 6.
( A ) Измеренная эффективность FRET между tC O и tC nitro для GC-repeat в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее сообщенной Z-формы структуры: записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO 4 ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z-форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33).( B ) Измерена эффективность FRET между tC O и tC nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO 4 (Z-форма), и представляют собой усредненные данные измерений в стационарном состоянии и в течение срока службы.
Последовательности с GC-повторами очень склонны к самодимеризации и образованию шпилек, и поэтому требуют другого и более тщательного дизайна последовательности по сравнению с нашим первоначальным эталонным исследованием (рис. 3A).Чтобы уменьшить помехи от образования шпильки, GC-повтор был сохранен как можно короче (14-мерный), при этом позволяя исследовать полный виток спирали, то есть донорно-акцепторное разделение до 10 п.н., без истирания концов. Кроме того, GC-повтор фланкирован одним базовым сайтом и восемью основаниями с каждой стороны. Восемь фланкирующих оснований были введены, чтобы удерживать концы вместе в А-форме на протяжении всего эксперимента и для повышения стабильности согласованного дуплекса в рамке считывания, тогда как базовые сайты служат гибким линкером, позволяющим формировать GC-повтор. Z-РНК, пока концы остаются в А-форме.
Для этого исследования использовали 8 M NaClO 4 для индукции Z-формы. Исследования CD показывают, что Z-форма стабильна при комнатной температуре в течение> 18 часов в этих условиях и что донор и акцептор не препятствуют ее образованию (дополнительный рисунок S3), что является дополнительным признаком того, что модифицированные основания РНК служат хорошими аналогами их естественные аналоги цитозина. Чтобы исследовать разницу между FRET в A- и Z-форме РНК, измерения с использованием времени жизни как стационарного излучения, так и флуоресценции были выполнены для обеих конформаций (Рисунок 6B, дополнительный рисунок S4 и дополнительные таблицы S5 и S6).Поскольку донор и акцептор в последовательностях GC находятся в одной цепи для нечетных разделений и в противоположных цепях для четных разделений, FRET-паттерн GC-повтора в A-форме отличается от эталонного исследования, в котором донор и акцептор являются в противоположных прядях для всех разделений (дополнительный рисунок S5). В данных Z-формы имеется несоответствие между эффективностями FRET в установившемся режиме и на основе срока службы для седьмого и девятого разделения (дополнительная таблица S7). Эти два разделения были измерены с использованием последовательностей, меченных одной и той же цепью, где образование шпильки может сблизить донор и акцептор в пространстве (0–2 пн).На таких коротких расстояниях тушение доноров может иметь непосредственный контакт (например, перенос электронов по Декстеру) и, следовательно, происходить во временном масштабе, который невозможно разрешить с помощью нашей настройки времени жизни флуоресценции. При таких обстоятельствах только время жизни правильно свернутой фракции образца, то есть дуплексов Z-формы РНК, будет видно в затухании флуоресценции, в то время как стационарная эмиссия будет дополнительно подавляться и, следовательно, вызывать кажущееся более высокое FRET значение. Поскольку наши результаты показывают разницу между установившимся режимом FRET и FRET на протяжении всей жизни на седьмом и девятом разделении и, следовательно, указывают на частичное образование «темных частиц» (например,грамм. шпильки) в этих образцах, для этих точек данных в последующей оценке использовались только значения эффективности FRET на основе срока службы (рисунок 6).
Во-первых, мы исследовали, можно ли использовать FRET между основаниями РНК для исследования перехода РНК от A- к Z. Разница в паттерне FRET между A- и Z-формами РНК поразительна, с изменением эффективности переноса на 25% -87% для семи из восьми исследованных разделений (рис. 6B), что указывает на то, что система достаточно чувствительна, чтобы изучить изменение между РНК в A- и Z-форме путем отслеживания изменения FRET только при одном или нескольких разделениях.Квантовый выход tC O по существу одинаков в обеих конформациях (дополнительная таблица S8), что убедительно свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения в эффективности переноса обусловлены структурными изменениями в РНК, а не вариациями в микроокружении зонда. Взятые вместе, это показывает, что межосновная РНК FRET между tC O и tC nitro , разделенными 4–10 п.н., может с высокой чувствительностью исследовать структурные изменения A- в Z-РНК, что дополнительно иллюстрирует общую адаптивность этого метода для исследование структурных изменений нуклеиновых кислот.Существенные различия в продолжительности жизни флуоресценции между соответствующими дуплексами РНК A- и Z-формы указывают на возможные применения микроскопии для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), в которой РНК, конкретно в Z-форме, может контролироваться с помощью микроскопии живых клеток.
Во-вторых, мы сравнили наши данные FRET с теоретически полученным паттерном FRET из нескольких существующих структур PDB. Паттерн FRET, который мы получили для Z-формы РНК, хорошо согласуется с паттернами ранее описанных структур на коротких и длинных расстояниях (рис. 6А).Однако на промежуточных расстояниях (6–8 п.н.) наблюдаемая эффективность FRET значительно ниже, чем значения, рассчитанные на основе опубликованных средних параметров 6-мерных структур PDB. Одним из объяснений этих расхождений может быть то, что структура Z-РНК отличается для ранее описанной короткой и по своей природе менее стабильной 6-мерной РНК по сравнению с нашей 14-мерной системой, где концы удерживаются на месте фланкирующими основаниями РНК А-формы. Структуры 6-мерной Z-РНК, определенные с помощью методов ЯМР или рентгеновского излучения, также могут немного отличаться от структуры в растворе при более физиологически значимых концентрациях РНК.Учитывая очень мало отчетов, содержащих структурную информацию для Z-формы РНК, слишком рано давать подробные комментарии о структурной однородности этой дуплексной формы РНК. Это потребует большего количества сравнительных исследований, посвященных таким аспектам, как длина олигорибонуклеотида и тип связывающего белка.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Мы показали, что пара tC O –tC nitro FRET хорошо подходит для мониторинга межосновного FRET в дуплексах РНК.Зонды прочно расположены внутри РНК, и паттерн FRET точно соответствует предсказанным значениям для A-РНК. Мы наблюдаем большое изменение эффективности FRET, поскольку Z-РНК образуется из A-формы с использованием высокой концентрации NaClO 4 , что показывает, что, как и в ДНК, межосновная РНК FRET может использоваться для исследования структурных изменений в физиологических условиях. с высокой чувствительностью, а также универсальностью в отношении шага tC O –tC nitro . При сравнении нашего измеренного паттерна FRET с несколькими существующими структурами PDB Z-формы РНК, мы обнаруживаем общие сходства, но также и существенные различия.Сходные по величине различия также могут быть обнаружены между структурами PDB, подразумевая, что необходимо исследовать больше структур Z-РНК, чтобы определить, имеет ли РНК Z-формы одну однородную структуру с уникальным набором параметров для извлечения. Учитывая более высокое структурное разнообразие и динамику РНК и комплексов РНК-белок по сравнению с ДНК, это представляет собой значительный шаг вперед не только для межосновного FRET как общей методологии нуклеиновых кислот, но, что важно, для быстрорастущей области структуры и динамики РНК. исследования в частности и исследования РНК в целом.В отличие от большинства методов исследования структуры и динамики, межбазовый FRET может выполняться в физиологических условиях. Следовательно, мы предполагаем, что основная полезность этого метода заключается в мониторинге структурных изменений РНК в системах живых клеток, либо отдельно, либо в гибридных подходах вместе с рентгеновскими лучами или ЯМР, для выявления ценной новой информации об основных молекулах жизни, РНК. .
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ
Дополнительные данные доступны в NAR Online.
БЛАГОДАРНОСТИ
Мы благодарим Афаф Х. Эль-Сагира и профессора Тома Брауна (Оксфордский университет, Великобритания) за обучение A.F.F. и М. в очистке РНК.
ФИНАНСИРОВАНИЕ
Шведский фонд стратегических исследований [SSF, IS14-0041, IRC15-0065 до L.M.W., ID14-0036 до M.G.]; Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707 к L.M.W.]. Финансирование платы за открытый доступ: Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707].
Заявление о конфликте интересов .Ничего не объявлено.
ССЫЛКИ
1.Dethoff
E.A.
,Chugh
J.
,Mustoe
A.M.
,Аль-Хашими
Х.М.
Функциональная сложность и регуляция через динамику РНК
.Природа
.2012
;482
:322
—330
.2.Harpur
A.G.
,Wouters
F.S.
,Bastiaens
P.I.H.
Визуализация FRET между спектрально подобными молекулами GFP в отдельных ячейках
.Nat. Biotechnol.
2001
;19
:167
—169
.3.Hillger
F.
,Hanni
D.
,Nettels
D.
,Geister
S.
,Grandin
M.
,Textor
M. Шулер
Б.
Исследование взаимодействий белок-шаперон с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул
.Angew. Chem. Int. Эд.
2008
;47
:6184
—6188
.4.Губаев
A.
,Klostermeier
D.
Klostermeier
D.
,Hammann
C.
Структура и складывание РНК: биофизические методы
.2013
;Берлин
Де Грюйтер
181
—214
.5.Peulen
T.O.
,Опанасюк
О.
,Зайдель
C.A.M.
Сочетание графических и аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа измерений FRET меченых макромолекул с временным разрешением
.J. Phys. Chem. В
.2017
;121
:8211
—8241
.6.McPhee
S.A.
,Huang
L.
,Lilley
D.M.
Критическая пара оснований в k витках, которая придает характеристики сворачивания и коррелирует с биологической функцией
.Nat. Commun.
2014
;5
:5127
.7.Dumat
B.
,Larsen
A.F.
,Wilhelmsson
L.M.
Изучение переходов Z-ДНК и B- в Z-ДНК с использованием аналога цитозина FRET-пары
.Nucleic Acids Res.
2016
;44
:e101
.8.Wranne
M.S.
,Füchtbauer
AF
,Dumat
B.
,Bood
M.
,El-Sagheer
AH
,Brown
T.
,, H.Grøtli
M.
,Wilhelmsson
LM
На пути к полной гибкости последовательности аналога основания нуклеиновой кислоты FRET
.J. Am. Chem. Soc.
2017
;139
:9271
—9280
.9.Füchtbauer
A.F.
,Preus
S.
,Börjesson
K.
,McPhee
S.A.
,Lilley
JD.M.
,Wilhelmsson
L.M.
Флуоресцентный аналог цитозина РНК — внутренний зонд для детальных исследований структуры и динамики
.Sci. Отчет
2017
;7
:2393
.10.Shin
D.
,Sinkeldam
R.W.
,Tor
Y.
Эмиссионный алфавит РНК
.J. Am. Chem. Soc.
2011
;133
:14912
—14915
.11.Ровира
A.R.
,Fin
A.
,Tor
Y.
Химический мутагенез алфавита эмиссионной РНК
.J. Am. Chem. Soc.
2015
;137
:14602
—14605
.12.Xie
Y.
,Dix
A.V.
,Tor
Y.
FRET позволяет в реальном времени обнаруживать связывание малых молекул РНК
.J. Am. Chem. Soc.
2009
;131
:17605
—17614
. 13.Tanpure
A.A.
,Srivatsan
S.G.
Конформационно-чувствительные аналоги нуклеозидов в качестве зондов включения флуоресценции, специфичных для топологии, для G-квадруплексов ДНК и РНК
.Nucleic Acids Res.
2015
;43
:e149
.14.Эрнандес
A.R.
,Kool
E.T.
Компоненты xRNA: Синтез и флуоресценция полного генетического набора расширенных по размеру рибонуклеозидов
.Org. Lett.
2011
;13
:676
—679
. 15.Börjesson
K.
,Preus
S.
,El-Sagheer
A.H.
,Brown
T.
,Albinsson
B.
,Wilhelmsson
L.M.
Аналог основания нуклеиновой кислоты FRET-Pair, облегчающий подробные структурные измерения в системах, содержащих нуклеиновые кислоты
.J. Am. Chem. Soc.
2009
;131
:4288
—4293
. 16.Bood
M.
,Füchtbauer
A.F.
,Wranne
M.S.
,Ro
J.J.
,Sarangamath
S.
,El-Sagheer
A.H.
,Rupért
D.L.M.
,Фишер
Р.С.
,Магеннис
S.W.
,Джонс
A.C.
et al. .Пентациклический аденин: универсальный и исключительно яркий флуоресцентный аналог основания ДНК
.Chem. Sci.
2018
;9
:3494
—3502
.17.Хан
J.H.
,Yamamoto
S.
,Park
S.
,Sugiyama
H.
Разработка системы Vivid FRET на основе высокоэмиссионной аналоговой пары dG-dC
.Chem. Евро. J.
2017
;23
:7607
—7613
. 18.Миллер
M.L.
,Доран
M.
Концентрированные солевые растворы.II. Вязкость и плотность тиоцианата натрия, перхлората натрия и йодида натрия
.J. Phys. Chem.
1956
;60
:186
—189
. 19.Preus
S.
,Kilså
K.
,Miannay
FA
,Albinsson
B.
,Wilhelmsson
LM
Метод моделирования FR и общий анализ FR FRET в нуклеиновых кислотах
.Nucleic Acids Res.
2013
;41
:e18
.20.Лю
X.J.
,Олсон
W.K.
3DNA: программный пакет для анализа, восстановления и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот
.Nucleic Acids Res.
2003
;31
:5108
—5121
. 21.Олсон
W.K.
,Бансал
М.
,Берли
S.K.
,Дикерсон
R.E.
,Gerstein
M.
,Harvey
S.C.
,Heinemann
U.
,Lu
X.J.
,Neidle
S.
,Shakked
Z.
et al. .Стандартная система координат для описания геометрии пары оснований нуклеиновых кислот
.J. Mol. Биол.
2001
;313
:229
—237
.22.Sandin
P.
,Börjesson
K.
,Li
H.
,Mårtensson
J.
,Brown
T.
, Wilhelm2Albinsson
B.
Характеристика и использование беспрецедентно яркого и структурно не возмущающего аналога флуоресцентного основания ДНК
.Nucleic Acids Res.
2008
;36
:157
—167
.23.Preus
S.
,Börjesson
K.
,Kilså
K.
,Albinsson
B.
,Wilhelmsson 9 acceptor
FR LM
. нитро .J. Phys. Chem. Б.
2010
;114
:1050
—1056
. 24.Чжэн
G.H.
,Лю
X.J.
,Olson
W.K.
Web 3DNA — веб-сервер для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот
.Nucleic Acids Res.
2009
;37
:W240
—W246
. 25.Серебряный
В.
,Бейгельман
Л.
Эффективный препарат защищенных рибонуклеозидов для синтеза фосфорамидитной РНК
.Tetrahedron Lett.
2002
;43
:1983
—1985
0,26.Sinha
ND
,Biernat
J.
,McManus
J.
,Köster
H.
Полимерная подложка, олигонуклеотидный синтез 9034-9034, β-N-N-904, 9034-9034, β-N-N 904 , N -Диалкиламино- / N -Морфолинофосфорамидит дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающих снятие защиты и выделение конечного продукта
.Nucleic Acids Res.
1984
;12
:4539
—4557
. 27.Xu
Y.
,Ishizuka
T.
,Kimura
T.
,Komiyama
M.
U-Tetrad стабилизирует структуру теломерной РНК человека 9 G-3.
J. Am. Chem. Soc.
2010
;132
:7231
—7233
. 28.Ван
А.H.J.
,Quigley
G.J.
,Колпак
F.J.
,Crawford
J.L.
,Vanboom
J.H.
,Vandermarel
G.
,Rich
A.
Молекулярная структура левостороннего двухспирального фрагмента ДНК при атомном разрешении
.Природа
.1979
;282
:680
—686
,29.Холл
К.
,Cruz
P.
,Tinoco
I.
,Jovin
T.M.
,Vandesande
J.H.
Z-РНК — двойная спираль левой РНК
.Природа
.1984
;311
:584
—586
. 30.Зарлинг
Д.А.
,Calhoun
C.J.
,Feuerstein
B.G.
,Сена
E.P.
Цитоплазматическая микроинъекция иммуноглобулина Gs, распознающего спирали РНК, подавляет рост клеток человека
.J. Mol. Биол.
1990
;211
:147
—160
. 31.Placido
D.
,Коричневый
B.A.
,Lowenhaupt
K.
,Rich
A.
,Athanasiadis
A.
Левосторонняя двойная спираль РНК, связанная Z-альфа-доменом редактирующего РНК фермента ADAR1
.Структура
.2007
;15
:395
—404
.32.Popenda
M.
,Milecki
J.
,Adamiak
R.W.
Структура высокосолевого раствора двойной спирали левой РНК
.Nucleic Acids Res.
2004
;32
:4044
—4054
. 33.Schwartz
T.
,Rould
M.A.
,Lowenhaupt
K.
,Herbert
A.
,Rich
A.
Кристаллическая структура Z-альфа-домена редактирующего фермента человека ADAR1, связанного с левой Z-ДНК
.Наука
.1999
;284
:1841
—1845
.Заметки автора
© Автор (ы) 2019. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.
получателей визы H-4 обеспокоены предлагаемым изменением правил
В 2015 году администрация Обамы изменила иммиграционные правила, чтобы позволить супругам обладателей визы H-1B, подающим заявление на постоянное проживание, работать в Соединенных Штатах. Этот шаг оказался популярным, поскольку владельцев визы H-4 в Северной Каролине и по всей стране позже подали заявки. Однако президент Трамп резко критиковал визы H-1B, которые позволяют работодателям нанимать квалифицированных иностранных рабочих, и пообещал тщательно изучить все аспекты программы.
Позиция и риторика Трампа беспокоили владельцев визы H-4 во время избирательной кампании, и их опасения оправдались в феврале, когда Министерство внутренней безопасности предложило отменить правило эпохи Обамы. Предложение в настоящее время рассматривается Управлением и бюджетом. В случае принятия предложение DHS больше всего затронет женщин из Китая и Индии, где очереди на иммиграцию являются одними из самых длинных в мире.
Предлагаемое изменение правила также может побудить владельцев визы H-1B пересмотреть свои варианты.Многие квалифицированные иностранные рабочие, получившие эти визы, работают в компаниях, базирующихся в таких городах, как Сан-Франциско и Нью-Йорк, где стоимость жизни чрезвычайно высока, и рабочие могут прийти к выводу, что получение ПМЖ финансово нереально, если им приходится полагаться только на одну зарплату .
Адвокаты, имеющие опыт работы в иммиграционных делах, могут посоветовать обеспокоенным владельцам визы H-4 их правовые варианты, поскольку законы по-прежнему могут измениться. Адвокаты могут предложить другие способы получения законного проживания или гражданства в Соединенных Штатах.Например, получатели H-4 могут иметь возможность получить визу для работы вне брака, такую как H-1B, или предпринимательскую визу, такую как EB-1, если у них есть экстраординарные способности.
Подпишитесь на ленту этого блогаАрхивы Выберите месяц март 2021 г. (5) февраль 2021 г. (3) январь 2021 г. (3) декабрь 2020 г. (5) ноябрь 2020 г. (3) октябрь 2020 г. (5) сентябрь 2020 г. (3) август 2020 г. (3) июль 2020 г. (4) июнь 2020 г. ( 5) май 2020 г. (4) апрель 2020 г. (7) март 2020 г. (1) февраль 2020 г. (7) январь 2020 г. (4) ноябрь 2019 г. (2) октябрь 2019 г. (3) сентябрь 2019 г. (2) август 2019 г. (3) июль 2019 г. ( 3) июнь 2019 г. (3) май 2019 г. (2) апрель 2019 г. (3) март 2019 г. (3) февраль 2019 г. (2) январь 2019 г. (5) декабрь 2018 г. (2) ноябрь 2018 г. (3) октябрь 2018 г. (2) сентябрь 2018 г. ( 3) август 2018 (5) июль 2018 (7) июнь 2018 (5) май 2018 (6) апрель 2018 (6)
Уголок с узлом лада | Караколе
Уголок с узлом лада
UPH-019-CR1-BКОЛЛЕКЦИЯ: ОБИВКА ИЗ КАРАКОЛА
Размеры в дюймах: 36.5 x 36,5 x 30,5 выс.
Размеры в сантиметрах: 92,71 Ш x 92,71 Д x 77,47 В
Создайте зону отдыха своей мечты с возможностью настройки этих элегантных сегментов сидений с изысканной резьбой. Исключительные снаружи внутри, эти вдохновляющие изделия украшены вставками из резных ладовых панелей, вставленных на их внешнюю сторону спины.Этот единственный в своем роде рисунок ладов был вдохновлен узким окном замка и решеткой, пропускающей воздух и свет. Обтянутый изысканной тканью, он предлагает безупречный стиль и удобное сиденье, завязанное вручную в восьми направлениях. Мягкая серебристая краска придает мерцание деталям, отделанным панелями, и ножкам с канавками.
ФУНКЦИИ:- Конические ножки с коническими канавками.
- Раскидывающая подушка на спине.
- Свободная подушка сиденья.
- Подушка пружины.
- Сиденье с ручным креплением в 8 направлениях.
- Пуховые подушки.
ОТДЕЛКА:
Мягкая серебряная краскаТКАНЬ:
Ткань корпуса: 2778 71CC Ткань подушки: 1 подушка 20 x 20 дюймов 8379 71CC 2 подушки 19 x 19 дюймов 3231 74CCИз-за различий, присущих мониторам и браузерам, образцы цветов могут отличаться на разных мониторах.Для наиболее точного представления, пожалуйста, обратитесь к физическим образцам, доступным у наших розничных продавцов.
ЛЮБИТЕ ЭТО, ПОДЕЛИТЬСЯ: печать Посмотреть TearsheetFRET-based in vivo ca2 + a визуализация с помощью новой слитой молекулы кальмодулин-GFP — Penn State
@article {30ce64ae0da0499aba89f139201f8f48,
title = «FRET-based in vivo ca2 + a imaging», визуализация с помощью новой слитой молекулы кальмодулин-GFP
abstract = «Внутриклеточный Ca2 + действует как вторичный посредник, который регулирует многочисленные физиологические клеточные явления, включая развитие, дифференцировку и апоптоз.