Экспресс-диагностирование- диагностирование по ограниченному числу параметров за заранее установленное время

Разное

Lada 4×4 new: Новое имя LADA Niva Legend

Содержание

Lada 4×4 2023 года — новая модель NG останется полноценным внедорожником?

Согласно последним сведениям от пресс-службы АвтоВАЗа, новое поколение бывшей классической «Нивы» окончательно решено перевести на иностранную платформу, предоставленную франко-японским альянсом Renault-Nissan-Mitsubishi, причем, возможно речь даже идет о новейшей модульной архитектуре CMFB-LS. Согласно более ранним сведениям, в основе новинки планировалось использовать проверенное «дастеровское» шасси B0 (Global Access).

Правда, как недавно выяснилось, выхода новой модели Lada 4×4 NG (New Generation) на рынок следует ожидать к 2023 году, именно к этому моменту АвтоВАЗ завершит переход всего своего актуального модельного ряда на общую с выпускаемыми в Тольятти автомобилями французской марки «тележку». Обособленным останется разве что производимое на вазовском заводе «Лада Ижевск» модельное семейство Lada Vesta и возможно недавно вернувшийся под полный контроль отечественного автогиганта внедорожник Niva, прежде выпускавшегося под маркой Chevrolet, хотя о ближайшем будущем последнего пока ничего неизвестно.

Словом, если с технической основой классического вазовского внедорожника уже становится все более или менее ясно, то приблизительный облик горячо ожидаемой новинки был раскрыт еще пару лет назад на примере концепта Lada 4×4 Vision (на фото и видео), представленного Волжским автозаводом в ходе Московского автосалона 2018. Как видим, никакой это не заурядный рестайлинг вроде стилистической версии Urban, а полноценный новый кузов, выполненный в современной вазовской стилистике «икс-фейс» с сохранением лишь наиболее узнаваемых особенностей экстерьера отечественной легенды бездорожья. В салон концепта пока удалось заглянуть только на расстоянии через стекла запертых дверей.

Перевод легендарного внедорожника «Нивы NG» образца 2023 модельного года на кроссоверную платформу с поперечным расположением двигателя и основной ведущей передней осью оправдано прежде всего в плане производственной рентабельности, поскольку текущую конструкцию «Лады 4х4» уже невозможно унифицировать с другими современными моделями АвтоВАЗа, что крайне затрудняет задачу нарастить объемы производства отечественного «полноприводника», а также снизить его себестоимость.

Кроме того, спрос на «настоящие» внедорожники в последнее время неуклонно снижается, например, объемы продаж Lada 4×4 уступают рыночным показателям даже таких куда более дорогих кроссоверов, как Volkswagen Tiguan и Kia Sportage, не говоря уже о бюджетных Hyundai Creta и Renault Duster.

Расставание с классической компоновкой должно лишить новую модель «Нивы» неразрезного заднего моста, передней подвески на двойных поперечных рычагах и понижающего ряда передач. Чтобы не превратить свой классический внедорожник в «еще один Дастер», на АвтоВАЗе в настоящее время занимаются поиском решения, позволяющего не копировать полностью кроссоверную схему с подключаемой задней осью посредством муфты, имеющей свойство перегреваться при относительно продолжительной работе.

По данным некоторых СМИ, Lada 4×4 2023 года получит доработанный вариант «дастеровской» полноприводной трансмиссии с понижающим рядом аналогично выпускаемой ныне «классике» — роль раздатки в таком случае будет выполнять пристыкованный к коробке передач планетарный редуктор с передаточным отношением 1,625.

В любом случае перед отечественным автогигантом стоит задача выпустить продукт, способный серьезно потеснить конкурентов на рынке кроссоверов, а для этого нужно производить как минимум 40 тысяч автомобилей ежегодно. Если новое поколение внедорожника на более современной технической основе будет стоить на уровне своего предшественника в сравнении с основными конкурентами из сегмента компактных вседорожников, новинка с такой броской внешностью имеет все шансы стать если не абсолютным лидером российского авторынка, то уж в своем классе точно.

Под маркой Niva будут выпускать несколько моделей — журнал За рулем

Раздача «предыдущим» Нивам дополнений к названиям — это расчистка дороги новому поколению.

Материалы по теме

Запуск в производство модели Lada Niva Travel подхлестнул интерес к вазовским внедорожникам и многих заставил размышлять на тему их будущего. Пожалуй, особенным катализатором тут стоит считать фразу президента АВТОВАЗа Ива Каракатзаниса, обычно весьма осторожного в высказываниях, сказанную на официальной церемонии старта сборки.

С возвращением легендарного названия Niva в семью LADA мы открываем новую страницу в его истории. Хочу вас заверить, что в ближайшие годы с этим именем будет связано много важных и интересных новостей», — заявил Ив Каракатзанис.

Что же это за новости, распланированные руководством предприятия на несколько лет вперед? Напомним, первому поколению внедорожника, сейчас выпускающемуся под именем Lada 4×4, в 2020 году исполнилось 43 года, и тем не менее на покой не собирается ни он, ни построенная на его основе «вторая» Нива, ныне Niva Travel. Постараемся представить, как будет развиваться ситуация с автомобилями повышенной проходимости под маркой Lada.

Niva Legend — так будет называться нынешняя Lada 4×4

В ноябре 2020 года появились неофициальные данные о том, что на конвейере АВТОВАЗа собрали три автомобиля Lada 4×4 в трехдверной версии, на которых соответствующий шильдик на крышке багажника заменен на надпись «Niva Legend», а вентиляционные отверстия на задней стойке кузова получили облицовку из пластика. В декабре выпустили еще два трехдверных автомобиля, причем один — в стандартном исполнении, а второй — в версии Urban.

Возможно, речь об очередной спецверсии, но зачем она нужна, если можно просто вернуть классической Ниве ее имя? Сколько она еще просуществует на конвейере — неизвестно, но ее ОТТС действует до декабря 2022 года. Впрочем, коммерческим наименованием в нем указано Lada 4×4, а если название сменится на Niva Legend, то действующее ОТТС будет обновлено, а заодно и продлится срок его действия.

Niva Travel переживет еще одно обновление

Автомобиль, который в конце 1990-х был спроектирован на АВТОВАЗе как внедорожник второго поколения ВАЗ-2123 Нива, пережил очередное перерождение и стартовал в производстве на заводе «Лада Запад Тольятти» 21 декабря 2020 года. У автомобиля новый капот, передние крылья, светотехника, бамперы. Есть некоторые изменения по конструктиву: переднюю часть силовой структуры кузова (т.н. «front end») модернизировали, сняв со снаряженной массы 20 кг.

Однако салон остался прежним, и вполне можно допустить, что одна из будущих новостей будет связана как раз с его обновлением. Нельзя исключать и легкий фейслифт: конфигурация нового переднего бампера вполне допускает интеграцию с фирменными хромированными «бумерангами», дающими так называемый «х-стиль», и такая задача новому дизайнеру Lada Жан-Филиппу Салару должна быть вполне по плечу. ОТТС на Niva Travel действует до декабря 2023 года, но в бытность этого автомобиля Нивой под брендом Chevrolet оно продлевалось неоднократно.

Niva NG появится в 2022–2023 годах

После обнародования названия Niva Travel в сети зазвучали предположения, что наличие второго слова в названии связано с намерением вернуть классической Lada 4×4 имя Нива. Однако мы помним, что по ней тоже есть планы переименования — и новое имя тоже будет состоять из двух слов: Niva Legend. Поэтому более вероятен другой вариант: раздача «предыдущим» Нивам дополнений к названиям означает, что служба маркетинга Lada расчищает дорогу новому поколению, которое будет называться просто Niva. Хотя вполне возможен вариант Niva NG (его используют внутри предприятия, имея в виду «new generation») или еще какой-либо — правила нейминга следующих поколений по отношению к предыдущим АВТОВАЗу еще только предстоит выработать.

Кроме того, это намекает на планы по параллельному выпуску всех трех автомобилей — что можно считать логичным, учитывая вполне стабильный спрос на выпускающиеся Lada Niva (в 2021 году — Niva Travel) и Lada 4×4. Поэтому вполне вероятно, что в ближайшие несколько лет нас ждет объединение нескольких автомобилей сегмента SUV в одну линейку или суббренд.

Что касается новой Нивы, то вплоть до настоящего момента она условно называлась в прессе «новой Lada 4×4», однако едва ли можно сомневаться в том, что, вернув владение наименованием Niva, АВТОВАЗ откажется от его использования в грядущем поколении внедорожника. Почти наверняка известно, что машина получит платформу CMFB-LS от третьего поколения Duster.

Фото: АВТОВАЗ

Новая Lada 4×4: эскизы, факты, прогнозы

Пока над новым внедорожником Lada висит плотная завеса тайны – на АВТОВАЗе считают, что рано раскрывать карты и важно запустить первые «прорывные» проекты – Vesta и Xray. Но нам хочется заглянуть немного дальше. Что мы и сделали.

Точных данных по новому внедорожнику действительно немного – на АВТОВАЗе не сообщают подробностей, опасаясь перегреть покупательский спрос. Однако в мае 2015 года об автомобиле с условным названием «Нива-3» по результатам визита на завод написал «Русский автомобиль», а в июне на Волжском автозаводе побывали представители клуба «Нива 4х4». Мы изучили опубликованную информацию, добавили собственных данных и, по традиции, постарались привести всё к общему знаменателю. Отметим, что первую попытку в этом направлении мы сделали в материале «Lada 4×4 нового поколения – подробности о ходе работ по проекту», а сейчас пришло время более глубокого анализа. Однако проект, по большому счёту, едва стартовал, поэтому призываем считать все приведённые в статье цифры и факты ознакомительными, дающими общее представление и не претендующими на статус абсолютно точных и окончательных.

Дизайн

Это, возможно, уже подзабылось, но классическая Нива была тем автомобилем, в котором Стив Маттин, по его собственным словам, нашёл источник вдохновения для того, самого первого концепта LADA XRAY 2012 года. Конечно, никакого цитирования он себе не позволил, но вспомните едва заметные, но очень стильные «надфарники» первого «ИксРея». А также тот факт, что обе эти машины – трёхдверный SUV. И вот Маттин возвращается к облику Нивы, уже на новом витке. Сейчас созданы два макета пропорций, 3- и 5-дверная версии, и хотя окончательные выводы о дизайне делать рано, но кое-что прикинуть можно. Известно, например, что напрямую транслировать стиль моделей Vesta и Xray на внедорожник не будут, хотя элементы этого стиля будут присутствовать. Но потребители просили сохранить образ, размеры (хотя речь, скорее, о пропорциях) и даже особенности поведения машины.

Впрочем, надо оговориться, что дело не только в Маттине – по некоторым данным, в проекте принимают непосредственное участие те, кто создавал два предыдущих поколения Нивы: дизайнер Валерий Сёмушкин и компоновщик Пётр Прусов. Кто-то из тех, кто видел стоящие в дизайн-центре АВТОВАЗа макеты пропорций, говорит, что они похожи на Honda Pilot с «пластикой» Grand Cherokee, кто-то – что на уменьшенную копию Range Rover с чертами Discovery. Общее настроение, таким образом, проясняется: строгие, довольно простые, но не рубленые формы. Из уст начальника управления дизайна Андрея Захарова известно, что дизайнеры стараются сохранить узнаваемый «нивовский» образ: в частности, «вертикальный» передок и брутальные, устойчивые к царапинам бамперы. В базовой версии они будут чёрными, но будет и версия Urban, где облик, как и у такой модификации текущего поколения Lada 4×4, будет ближе к кроссоверу.

На рисунках, которые вы видите в этой статье – не официальные скетчи, а первая попытка специалистов Artrace Car Design Studio представить, каким может быть новый внедорожник, проектируемый в рамках проекта Lada 4×4 NG («New Generation»), как его именуют на АВТОВАЗе.

Габариты

При компоновке нового внедорожника вазовцы во многом оглядываются на ход проекта Chevrolet Niva второго поколения, что вполне логично: АВТОВАЗ является акционером СП GM-AVTOVAZ, и в инженерных кругах этих компаний имеет место давнее сотрудничество. И джиэмовцы, и вазовцы пошли по пути глубокой модернизации платформы Chevrolet Niva первого поколения, то есть, по сути, автомобиля ВАЗ-2123, рождённого на Волжском автозаводе. Однако на АВТОВАЗе оговариваются – нельзя сказать, что новый внедорожник будет использовать платформу нынешней Chevrolet Niva. «Почти не используется» силовой каркас и ни одной детали в чистом виде на новую машину не перекочует, всё будет меняться. Может быть, правильнее говорить даже не о глубокой модернизации, а о некоем переосмыслении накопленного опыта.

Но вот габариты нового вазовского внедорожника получаются близкими к «Шниве». Длина пятидверной версии – 4 100 мм (у Chevrolet Niva – 4 056 мм). Колёсная база – 2 450 мм (точно, как на Chevrolet Niva). Вместе с тем, задний свес гораздо длиннее, чем у Chevrolet, и поэтому объём багажника (в который переехала, наконец, запаска) получился на уровне 400 литров, в то время как у Chevrolet – 320 литров, а у нынешней Lada 4×4 – всего 265 литров. Трёхдверная версия Lada 4×4 NG короче пятидверки по базе на 150 мм, (2 300 мм), но это на 100 мм больше, чем имеет короткобазная версия Lada 4×4 сейчас. Задний свес, в силу максимальной унификации, будет почти столь же длинным, как у пятидверки, поэтому и колесо тоже будет лежать под днищем, и багажник будет почти столь же вместительным. Колея у вазовских внедорожников в новом поколении увеличится на 80 мм, чуть вырастет и ширина колёс – до 205 мм. Высоту кузова увеличили во имя более удобной посадки – до цифры порядка 1 600 мм.

Все цифры – предварительные и неофициальные, но едва ли они изменятся слишком сильно: пропорции и общая компоновка уже утверждены, а вот концепцию дизайна «заморозят» только в конце года.

Платформа и силовые агрегаты

В беседе с журналистами Kolesa.ru главный инженер Lada 4×4 нынешнего и будущего поколений Иван Блинов отметил: «Мы стараемся сохранить постоянный полный привод и продольное расположение двигателя». Другие сообщения в интернете преподносят это как свершившийся факт: для нового поколения утверждена именно такая архитектура. И это похоже на правду, если учесть, что преемственность (пусть даже исключительно идеологическая) в платформах новой и старой Нивы всё же присутствует.

Есть версия, что базовым мотором для нового внедорожника станет ВАЗ-21176 – новый бензиновый 1,8-литровый мотор с мощностью порядка 122 л.с. Первым этот мотор получит высокий хэтчбек Lada Xray. Кроме того, не исключено и долгожданное появление дизеля, и возможно, что это будет уже примеренный на текущее поколение Lada 4×4 шестнадцатиклапанный мотор Fiat 1,3 MultiJet. У этого мотора несколько степеней форсировки, причем с небольшой «ступенькой»: известно о 75-, 85- и 90-сильных модификациях.

А что с трансмиссией? Как известно, для того же «ИксРея» анонсирована роботизированная коробка АМТ, причем в сочетании с новым бензиновым двигателем 1,8. Этот вазовский «робот» получен из механической коробки 2180, и он справляется с крутящим моментом в 173 Нм. Но Lada 4×4 NG, как мы отмечали выше, будет иметь продольное расположение силового агрегата. «Классическая» вазовская коробка, которая стоит на Lada 4×4 сейчас, рассчитана максимум на 150 Нм, а в усиленном виде, по некоторым оценкам, может потянуть всего 165 Нм. Дизель же, если брать умозрительный вариант с Fiat 1,3 MultiJet, развивает, в зависимости от степени форсировки от 180 до 200 Нм. Это значит, что вазовцам предстоит выбор: попробовать найти последние резервы по модернизации нынешней коробки, использовать коробку со стороны (например, применив что-то из арсенала Renault-Nissan) или запустить производство новой трансмиссии.

Целевая аудитория, производство и сроки запуска

Задачей разработчиков Lada 4×4 NG является развитие традиций прежней Нивы, причем как с точки зрения дизайна, так и с точки зрения технических возможностей. Это по-прежнему будет достаточно простой по конструкции, недорогой, выносливый и, если позволите, харизматичный автомобиль, обладающий исключительной проходимостью. Но он должен стать вместительнее, комфортнее и мощнее. А значит, к старой армии поклонников должны добавиться новые покупатели. Вероятно, что целевая аудитория прирастёт за счёт молодого поколения автомобилистов.

Буквально только что закончены работы над пропорциями будущих внедорожников и параллельно запущены два комплекса работ – по дизайну и по конструкции. Осуществлять эти работы последовательно АВТОВАЗ себе позволить не может – слишком мало времени: если верить последней редакции графика выхода новых моделей (надо заметить, впрочем, что график получен представителями СМИ не по официальным каналам), серийная версия Lada 4×4 NG должна встать на конвейер в середине 2018 года. Другие источники утверждают, что вазовцы постараются сделать это даже раньше, в конце 2017 года. Для сборки нового поколения пока определены те производственные мощности, на которых выпускается нынешняя Lada 4×4. В таком случае производство будет существенно модернизировано, но на сегодняшний день, по нашим данным, никаких подготовительных процедур в цехах не ведётся – слишком рано.

Кстати, у модели пока нет названия – едва ли наименование Lada 4×4 NG можно рассматривать в качестве рыночного, а ведь вместе с новым поколением будет выпускаться и «классическая», но модернизированная Lada 4×4. Слово «Нива», как мы знаем, использовать в названии нельзя – оно принадлежит General Motors. Так давайте придумаем машине новое имя! Ждём ваших вариантов в комментариях. Если этих вариантов будет много, и они будут стоящие, то будем голосовать за лучшие и, может быть, даже учредим призы авторам. Варианты направим на АВТОВАЗ – поверьте, они ломают голову над новым названием не меньше, чем над конструкцией.

Понятно, что вопросов по Lada 4×4 NG пока очень много, и ответов на многие из них, вероятно, не знают даже те, кто эту машину создаёт. Поэтому давайте наберёмся терпения и подождём…

«Колеса.ру»

комплектации и цены Lada 4×4 Urban 5 дверей 2020-2021 у официального дилера в Москве

1.7 / 83 л.c.
5МТ / 4WD

Шины

Размерность

185/75 R16 (92/93/95, Q/Т)

Кузов

Длина

Высота

Ширина

Тип кузова

Колёсная база

Количество мест

Дорожный просвет

Количество дверей

Колея задних колес

Колея передних колес

Расположение двигателя

Переднее продольное

Колесная формула / ведущие колеса

Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом вариантах

Масса

Снаряженная масса

Объем топливного бака

Технически допустимая максимальная масса

Подвеска

Задняя

Зависимая, рычажная, пружинная, с гидравлическими телескопическими амортизаторами

Передняя

Независимая, на поперечных рычагах, пружинная, с гидравлическими телескопическими амортизаторами и стабилизатором поперечной устойчивости

Двигатель

Топливо

Код двигателя

Рабочий объем

Тип двигателя

Система питания

Впрыск топлива с электронным управлением

Максимальная мощность

61 кВт (83 л. с.) при 5000 об/мин

Максимальный крутящий момент

129 Нм при 4000 об/мин

Количество, расположение цилиндров

Трансмиссия

Тип трансмиссии

Передаточное число главной передачи

Расход топлива

Городской цикл

Смешанный цикл

Загородный цикл

Динамические характеристики

Время разгона 0-100 км/ч

Максимальная скорость

Сенсоры FRET нового поколения для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

Abstract

Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), могут активировать гетеротримерный комплекс G-белка с кинетикой менее секунды.

Генетически кодируемые биосенсоры, основанные на переносе энергии резонанса Фёрстера (FRET), идеально подходят для изучения таких быстрых сигнальных событий в отдельных живых клетках. Здесь мы сообщаем о конструкции и характеристике трех биосенсоров FRET для измерения активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 .Чтобы обеспечить количественную долгосрочную визуализацию биосенсоров FRET с высоким динамическим диапазоном, необходимы флуоресцентные белки с улучшенными фотофизическими свойствами. Поэтому в качестве донора, слитого с субъединицей Gα и , мы используем самый яркий и фотостабильный на данный момент вариант CFP, mTurquoise2, а в качестве акцептора cp173Venus, слитый с субъединицей Gγ 2 . Конструкции биосенсоров Gα и FRET экспрессируются вместе с Gβ 1 из одной плазмиды, обеспечивая предпочтительные относительные уровни экспрессии с уменьшенной изменчивостью в клетках млекопитающих.Сенсоры Gα
и FRET продемонстрировали устойчивый ответ на активацию эндогенных или гиперэкспрессированных альфа-2А-адренорецепторов, которая ингибировалась коклюшным токсином. Кроме того, мы наблюдали активацию сенсора Gα и FRET в одиночных клетках при стимуляции нескольких GPCR, включая рецепторы LPA 2 , M 3 и BK 2 . Кроме того, мы показываем, что датчики хорошо подходят для извлечения кинетических параметров из быстрых измерений в миллисекундном временном диапазоне.Это новое поколение биосенсоров FRET для активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 будет полезно для измерений живых клеток, которые исследуют активацию Gα i .

Образец цитирования: van Unen J, Stumpf AD, Schmid B, Reinhard NR, Hordijk PL, Hoffmann C, et al. (2016) Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gα

i1 , Gα i2 и Gα i3 в одиночных клетках. ПЛОС ОДИН 11(1): e0146789.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789

Редактор: Микель Гарсия-Маркос, Школа медицины Бостонского университета, США

Получено: 25 сентября 2015 г. ; Принято: 22 декабря 2015 г.; Опубликовано: 22 января 2016 г.

Авторское право: © 2016 van Unen et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и в его файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Авторы не имеют поддержки или финансирования для отчета.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Подкласс Gα i гетеротримерных G-белков состоит из 3 членов у человека, Gα i1,2,3 кодируется генами GNAI1, GNAI2, GNAI3 [1] и активируется широким спектром Рецепторы, связанные с G-белком. Семейство Gα и G-белков вовлечено в многочисленные патологии, от участия в ожирении и диабете [2], функций в иммунной системе [3] до их критических ролей на нескольких стадиях биологии рака [4–7]. . Активация Gα и преимущественно связана с ингибированием аденилатциклаз, что приводит к снижению накопления цАМФ в клетках. Однако активация Gα и совсем недавно была связана с несколькими другими молекулярными эффекторами, включая PI3K/Akt [8,9], ERK [10] и c-Src [5].

Измерение активации Gα и классически выполняется путем измерения ингибирования индуцированной форсколином продукции цАМФ. Подобно анализам фосфорилирования, расположенным ниже по течению, такие измерения не имеют пространственного разрешения, имеют ограниченное временное разрешение и могут зависеть от значительных перекрестных помех и усиления или десенсибилизации сигнала [11-13].

Для прямого исследования активации G-белка с высоким пространственно-временным разрешением можно использовать генетически кодируемые биосенсоры FRET (Förster Resonance Energy Transfer) или BRET (Bioluminescent Resonance Energy Transfer) [14]. Эти методы основаны на измерении безызлучательной передачи энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору, которая имеет место только тогда, когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости друг от друга (<10 нм). Изменения расстояния или ориентации между донорным и акцепторным диполем приводят к изменениям эффективности RET, которые можно измерить количественно.

Методы RET позволяют регистрировать кинетику отдельных клеток с разрешением в миллисекунды, что можно использовать для выявления межклеточной гетерогенности и записи фармакокинетических параметров.Более того, этот подход может регистрировать активацию GPCR в физиологических условиях in vivo [15].

Gα i был успешно помечен в различных внутренних сайтах люциферазой и использован для измерений BRET между различными субъединицами Gα i и GPCR [16–19] или Gγ [19]. Также были выполнены измерения FRET между флуоресцентно меченными Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 и Gβ [20] или Gγ [21].

Для выполнения измерений FRET необходима спектрально перекрывающаяся пара донора и акцептора [24], и ранее было показано, что использование более ярких флуоресцентных белков может повысить чувствительность измерений биосенсора FRET [22,23].Чтобы получить надежные измерения FRET, которые исследуют активацию Gα i , мы сделали слияние Gα i1 Gα i2 и Gα i3 с самым ярким и наиболее фотостабильным мономерным голубым флуоресцентным белком (CFP), доступным в настоящее время, mTurquoise2. (mTq2) [25]. В качестве акцептора мы использовали кольцевую пермутантную Венеру (cpVenus), слитую с Gγ 2 , которая ранее использовалась в качестве акцептора в одиночном плазмидном сенсоре Gα q FRET [26]. Мы используем единую плазмидную стратегию, чтобы облегчить протоколы трансфекции и обеспечить четко определенное соотношение экспрессии донора и акцептора в клетках [27].Эта стратегия выражения должна значительно облегчить использование и воспроизводимость результатов этих датчиков. Мы представляем стратегию построения, проверку и характеристику этого нового поколения датчиков FRET для активации Gα i1 Gα i2 и Gα i3 . Эти биосенсоры очень хорошо подходят для микроскопии живых клеток и могут использоваться для быстрых кинетических измерений в миллисекундном диапазоне, что позволяет характеризовать фармакологические препараты и определять включение и выключение кинетики агонистов и антагонистов Gα и -связанных GPCR.

Результаты

Создание конструкций

Мономерный вариант CFP mTurquoise2, предпочтительный донор в парах CFP-YFP FRET из-за его высокого квантового выхода и фотостабильности [25], был вставлен в Gα i1 после аланина в положении 121 в петле αB-αC. Ранее было показано, что этот сайт встраивания сохраняет нуклеотидный обмен и скорость реакции GTPase, сравнимую с белком дикого типа [20]. Gα i1 -mTq2 демонстрирует локализацию в плазматической мембране при экспрессии в клетках HeLa (рис. 1А).Были проведены пробные эксперименты, чтобы проверить, подходит ли Gα i1 -mTq2 для измерения с помощью FRET активации гетеротримерного комплекса G-белка при активации GPCR. С этой целью как Gβ, так и Gγ могут быть помечены акцептором для измерения активации гетеротримерного G-белка с помощью FRET [20,21]. Ранее мы показали, что самый высокий контраст FRET для Gα q достигается с cpVenus-Gγ 2 [26]. Поскольку Gα i имеет высокую структурную гомологию с Gα q , а сайт, в который вставляется mTurquoise2, аналогичен, мы решили использовать здесь тот же акцептор FRET.Поэтому для введения в клетки меченого гетеротримерного комплекса G-белка мы коэкспрессировали Gα i1 -mTq2 вместе с акцептором FRET cpVenus-Gγ 2 и немеченым Gβ 1 [26]. Стимуляция коэкспрессированного адренергического рецептора α 2 (α 2 AR) с помощью UK14,304 показывает быстрое увеличение флуоресценции CFP и сопутствующую потерю сенсибилизированной эмиссии из канала YFP, что отражает потерю FRET. Утрату FRET можно интерпретировать как диссоциацию гетеротримера или изменение относительной конформации донора и акцептора.Чтобы обеспечить надежную совместную экспрессию различных компонентов мультимерного сенсора FRET, мы ввели субъединицы в одну и ту же плазмиду, как сообщалось ранее для сенсора Gα q (рис. 1B) [26]. Эта стратегия использует вирусный пептид 2A и последовательность IRES для обеспечения оптимальных относительных уровней донора (Gα i1 -mTq2) и акцептора (cpVenus-Gγ 2 ) в отдельных клетках, минимизируя гетерогенность межклеточной экспрессии. в образце. После создания нашего первого варианта мы заметили, что Gα i1 -mTq2 был неправильно локализован в цитоплазме во многих клетках (рис. 1C).Субъединица Gα i1 миристоилирована и требует остатка глицина сразу после исходного метионина. Детальный анализ последовательности плазмиды выявил дополнительный стартовый кодон для Gα i1 -mTq2 выше нативного стартового кодона, генерируемый последовательностью IRES (фиг. 1B). Мы предположили, что в нашем первом варианте сенсора большая часть продуцируемого белка Gα i1 -mTq2 была транслирована с вышестоящего метионина в последовательности IRES, что не приводит к миристоилированному белку.Мы удалили восходящий метионин с помощью полновекторной ПЦР (см. Материалы и методы), которая оставляет только нативный стартовый кодон Gα i1 -mTq2, за которым следует глицин, обеспечивающий консенсусную последовательность для миристоилирования. Действительно, после трансфекции клеток новой плазмидой мы наблюдали правильно локализованные Gα i1 -mTq2 (рис. 1B и 1C). Аналогичным образом были сконструированы датчик Gα i2 и датчик Gα i3 . Чтобы изучить совместную экспрессию трех субъединиц (Gα i1 -mTq2, Gβ 1 и cpVenus-Gγ 2 ) из одной плазмиды по сравнению с тремя отдельными плазмидами, мы количественно оценили флуоресценцию CFP и YFP в этих двух экспериментальных условия (рис. 1D).Флуоресценция CFP и YFP в стратегии трансфекции с одной плазмидой имела коэффициент детерминации r 2 , равный 0,64, тогда как трансфекции тремя отдельными плазмидами показали коэффициент детерминации r 2 , равный 0,36, между интенсивностью CFP и интенсивностью YFP. Другими словами, корреляция между экспрессией CFP и YFP лучше в конфигурации с одной плазмидой, что указывает на явное преимущество этой конструкции. Дополнительным преимуществом этой плазмиды является экспрессия белка 3:1 выше и ниже последовательности IRES, что, как было показано ранее, приводит к предпочтительному соотношению экспрессии донора (CFP) и акцептора (YFP) для аналогичного Gα q FRET. датчик [27].Наконец, конструкции с одной плазмидой упростят введение в первичные клетки, создание стабильных клеточных линий или трансгенных организмов с Gα i -сенсорами.

Рис. 1. Разработка и характеристика нового датчика Gα i1 .

(A) Репрезентативное изображение, показывающее локализацию на плазматической мембране Gα i1 , слитого с mTurquoise2-Δ9, экспрессированного в клетках HeLa. (B) Схематический обзор плазмиды, содержащей pGβ-2A-YFP-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -CFP, управляемой промотором CMV.На вставке показана последовательность ДНК, кодирующая конец последовательности IRES и начало последовательности Gα i1 . Предлагаемая трансляция белка показана в строке ниже последовательности ДНК (однобуквенные сокращения аминокислот). (C) Конфокальные изображения локализации Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 ( верхний ряд ) и cp173Venus-Gγ 2 ( нижний ряд ) в клетках HeLa, для варианта 1.0 ( левый столбец ) и вариант 2.0 ( правая колонка ) датчика Gα i1 .(D) Количественный анализ коэкспрессии каналов CFP и YFP трансфекций cp173Venus-Gγ 2 и Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 в клетках HeLa. Трансфекция одной плазмидой ( слева ) по сравнению с трансфекцией отдельными плазмидами ( справа ). Точки изображают интенсивность CFP и YFP, количественно определяемую по отдельным одиночным клеткам. r 2 – коэффициент детерминации. Ширина отдельных изображений в A и C составляет 143 мкм.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0146789.g001

Эффективность в анализах активации GPCR

Чтобы протестировать новый биосенсор Gα i1 при визуализации живых клеток, мы использовали хорошо охарактеризованный GPCR, который, как известно, связывается с Gα i1 , адренергическим рецептором α 2 (α 2 AR). Клетки HeLa, для которых ранее было показано, что они эндогенно содержат α 2 AR [20], трансфицировали биосенсором Gα i1 . При добавлении 10 мкМ UK14,304 мы наблюдали устойчивую потерю FRET, измеряя соотношение между флуоресценцией YFP и CFP биосенсора Gα i1 , которое возвращалось к исходному уровню при добавлении 60 мкМ α 2 AR. антагонист йохимбин (рис. 2А).Было показано, что коклюшный токсин (PTX) инактивирует передачу сигналов Gα и в клетках посредством АДФ-рибозилирования субъединицы Gα i [28], что предотвращает ее взаимодействие с GPCR. Активация Gα i1 полностью прекращалась при инкубации в течение ночи с РТХ, показывая, что слитый белок Gα i1 -mTq2 по-прежнему чувствителен к РТХ (рис. 2А). Чтобы подтвердить, что датчик можно использовать для анализа активации Gα i1 эндогенных рецепторов в первичных клетках, мы повторили этот эксперимент в HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека).Добавление хорошо известного стимулятора HUVEC, S1P [29], вызывало устойчивое снижение отношения FRET сенсора Gα i1 (рис. 2B), ночная обработка PTX полностью устраняла этот ответ. Затем, чтобы исследовать, насколько надежно датчик Gα i1 работает в других анализах активации GPCR, мы протестировали множество GPCR, которые, как было показано, связываются с Gα i . Рецептор брадикинина 2B (BK 2B ) [30], рецептор лизофосфатидной кислоты 2 (LPA 2 ) [31, 32] и рецептор мускаринового ацетилхолина 3 (M 3 ) [33, 34] котрансфицировали с биосенсор Gα i1 в клетках HeLa. При стимуляции соответствующими агонистами все три рецептора показали устойчивое снижение отношения FRET биосенсора Gα i1 (рис. 2C). Рецептор M 3 также показал полное восстановление отношения FRET до исходного уровня после добавления антагониста атропина. Рецептор M 3 в основном известен своей передачей сигналов через Gα q . Тем не менее, предыдущие исследования показали активацию Gα i через рецептор M 3 [19,33–36], что соответствует нашим наблюдениям.

Рис. 2. Характеристики датчиков Gα и в анализах передачи сигналов GPCR в одиночных клетках.

(A) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных с помощью датчика Gα i1 . Быстрая потеря FRET, наблюдаемая по уменьшению отношения YFP/CFP, после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, специфичного агониста α 2 AR, добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка РТХ (100 нг/мл) устраняет ответ на Gα i1 -сенсор в клетках, стимулированных UK-14304.(B) Эксперименты по визуализации соотношения FRET у Huvecs, трансфицированных датчиком Gα i1 . Устойчивая потеря FRET наблюдается после стимуляции 500 нМ S1P (сфингозин-1-фосфат). Ночная обработка РТХ (100 нг/мл) устраняет ответ на Gα i1 -сенсор в клетках, стимулированных S1P. (C) Эксперименты с визуализацией отношения FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gα i1 и BK 2B ( вверху справа ), LPA 2 ( вверху слева ), M 3 ( внизу справа ) и β 2 AR-2A2-mCherry ( внизу слева ) стимулировали 1 мкМ брадикинина (BK 2B ), 1 мкМ лизофосфатидной кислоты (LPA 1 мкМ 2 6), (M 3 ) или 10 мкМ изопротеренола и 10 мкМ пропранолола (β 2 AR).Клетки HeLa, трансфицированные рецепторами BK 2B , LPA 2 и M 3 , демонстрируют четкое изменение соотношения YFP/CFP FRET при добавлении соответствующих агонистов, тогда как стимуляция β 2 AR не изменяет FRET. отношение датчика Gα i1 . В контрольных условиях клетки HeLa с трансфицированным только Gα i1 сенсором получали идентичные стимуляции. (D) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα i2 или датчиком Gα i3 .Быстрая потеря FRET наблюдается после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, последующее добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка коклюшным токсином (PTX) (100 нг/мл) устраняет ответ биосенсоров Gα i2 и Gα i3 в клетках, стимулированных UK-14304. Клетки HeLa стимулировали агонистом при t = 32 с, а антагонист добавляли при t = 152 с, где указано. Клетки Huvec стимулировали S1P при t = 55 с.Кривые времени показывают среднее изменение соотношения флуоресценции YFP/CFP (± sem). Средние кривые состоят из данных не менее 3 независимых экспериментов, проведенных в разные дни, с указанным числом клеток ( n ) на условие.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g002

В контрольных условиях, т.е. В отсутствие сверхэкспрессии GPCR мы стимулировали клетки HeLa соответствующими агонистом и антагонистом и наблюдали лишь очень незначительный ответ на сенсоре Gα i1 в случае стимуляции LPA.Скорее всего, это связано с активацией эндогенных LPA-рецепторов в клетках HeLa [37]. Когда мы совместно трансфицировали адренергический рецептор β 2 (β 2 AR), ни одна из клеток не показала активации Gα i1 в ответ на лечение агонистом и антагонистом (рис. 2C). Следует отметить, что β 2 AR является классическим активатором Gα s , но при определенных условиях сообщалось о переключении на Gα i [38]. Наши результаты согласуются с единственным известным нам исследованием, в котором используются аналогичные инструменты (сенсоры на основе BRET) и аналогичные условия (сверхэкспрессированные β 2 AR и гетеротримерные сенсоры G-белка) [19]. Также в этом случае не наблюдалось активации Gα i1 при стимуляции β 2 AR (и лишь незначительная активация Gα i2 и Gα i3 , которая была более чем в 10 раз ниже, чем активация альфа-2C). адренергический рецептор, сильный активатор Gα i ).

Чтобы проверить работу биосенсоров Gα i2 и Gα i3 , мы трансфицировали клетки HeLa соответствующими плазмидами. Подобно эксперименту с биосенсором Gα i1 на рис. 2А, мы наблюдали устойчивую потерю FRET после добавления 10 мкМ UK14,304, а сигнал возвращался к исходному уровню после добавления 60 мкМ йохимбина (рис. 2D).В этих экспериментальных условиях мы не наблюдали существенных различий в кинетике активации или амплитуде ответов между тремя различными субъединицами Gα и . И Gα i2 -mTq2, и Gα i3 -mTq2 по-прежнему чувствительны к лечению PTX, о чем свидетельствует исчезновение ответа FRET после инкубации в течение ночи с PTX (рис. 2D).

Быстрые кинетические измерения

Чтобы более подробно изучить кинетику активации Gα i1 в живых клетках за доли секунды, клетки HEK293 котрансфицировали сенсором Gα i1 и α 2 AR или рецептором аденозина A1, соответственно.Используя систему быстрой перфузии для нанесения лиганда, измерения FRET в одиночных клетках показывают быструю потерю коэффициента FRET более чем на 15% после кратковременного применения 20 мкМ норэпинефрина. После вымывания лиганда сигнал FRET возвращается к базовым уровням. Это можно было воспроизвести несколько раз без видимой потери амплитуды сигнала (рис. 3А). Аналогичный ответ наблюдался для аденозинового рецептора A1 после кратковременного применения эндогенного лиганда аденозина (30 мкМ) (рис. 3В).

Рис. 3.Характеристики датчика Gα i1 при кинетических измерениях. Клетки

(A) HEK293, трансфицированные датчиком Gα i1 и AR α 2 , неоднократно стимулировали 20 мкМ норадреналина в течение интервалов, которые обозначены короткими горизонтальными линиями. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированное и нормализованное отношение FRET.(B) Клетки HEK293, трансфицированные Gα i1 -сенсором и аденозиновым A1-рецептором, стимулировали 30 мкМ аденозина, что обозначено короткой горизонтальной линией. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированное и нормализованное отношение FRET. (C) Крупный план он-кинетики активации Gα i1 , показывающий нормализованное отношение FRET во время первой стимуляции эксперимента в (A), приспособленное к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания с tau = 1160 мс и амплитудой = 0.18 (R = 0,99). (D) Диаграмма рассеяния, показывающая средние экспоненциальные константы времени (tau) объединенных данных из (n = 10) отдельных подборок клеток HEK293, трансфицированных датчиком Gα i1 , и AR α 2 , стимулированных 100 мкМ норадреналина или объединенных данные (n = 14) из отдельных подходов датчика Gα i1 и аденозинового A1-рецептора, стимулированного 30 мкМ аденозина, соответственно. Столбики погрешностей указывают на 95% ДИ.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g003

Эти быстрые измерения FRET можно использовать для оценки кинетики активации Gα i1 с разрешением менее секунды (рис. 3C), как показано крупным планом первой стимуляции в эксперименте, показанном на рис. 3А. Кривая была подогнана под однокомпонентную экспоненциальную функцию затухания, как описано ранее [39], в результате чего экспоненциальная постоянная времени (τ) составила 1160 мс.

Для оценки точной кинетики скорости включения Gα i1 -сенсора клетки стимулировали насыщающими концентрациями лиганда (100 мкМ норадреналина или 30 мкМ аденозина).Каждый отдельный ответ был подогнан под однокомпонентную экспоненту, в результате чего средние значения τ для α 2 AR составили 887 мс, а для аденозина A1 – 963 мс (рис. 3D), что соответствует периодам полураспада 614 мс и 668 мс соответственно. Эти значения хорошо согласуются с более ранними наблюдениями за активацией G-белка с помощью FRET [21,40,41].

Заключительные замечания

В этой рукописи мы описываем дизайн, конструкцию и характеристики трех новых биосенсоров FRET для измерения активации Gα i1 , Gα i2 , Gα i3 .Новые сенсоры содержат субъединицу Gα, слитую с донорным флуорофором, mTurquoise2, и субъединицу Gγ, слитую с cp173Venus, поскольку ранее было показано, что эта комбинация для сенсора Gα q FRET обеспечивает наибольший динамический диапазон [26]. Три субъединицы гетеротримера (Gα i -mTq2, Gβ 1 и cpVenus-Gγ 2 ) были сконфигурированы на одной плазмиде, обеспечивая надежную коэкспрессию с предпочтительной стехиометрией. Мы показываем, что эти датчики хорошо подходят для микроскопии живых клеток и извлечения кинетических параметров с помощью одноклеточной логометрической визуализации FRET.Стандартизированная компоновка этих биосенсоров FRET для активации G-белка повысит надежность и воспроизводимость экспериментов внутри и между лабораториями. В данной статье это иллюстрируется надежной работой датчика Gα i1 в трех разных лабораториях без оптимизации условий эксперимента.

Одним из ограничений биосенсоров на основе переноса энергии для гетеротримерных G-белков является то, что они зависят от сверхэкспрессии гетеротримера, что может повлиять на естественное предпочтение GPCR для определенного класса гетеротримерных G-белков.Мечение эндогенных субъединиц флуоресцентными белками потенциально может облегчить это.

Исключительная чувствительность этих датчиков позволяет надежно обнаруживать активацию Gα и в первичных клетках с помощью эндогенных GPCR. Более того, эти биосенсоры можно использовать для прямого сравнения предпочтительных паттернов активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 между различными Gα и , связанными GPCR, что может помочь в разработке терапевтических стратегий, нацеленных на Gα и . сигнальные пути [42].

Методы

Конструирование слияний флуоресцентных белков

Для вставки mTurquoise2-Δ9 (здесь сокращенно mTq2) [25] в белки Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 , вариант mTq2 с сайтами рестрикции Age1 на его N-конце и C-конце был сконструирован путем амплификации mTurquoise2 с прямым праймером 5′-ATaccggttctATGGTGAGCAAGGGCG-3′ и обратным праймером 5′-TAaccggtGATCCCGGCGGC-3′. Для введения Age1-сайта в Gα i1 -цитрин мы провели полновекторную ПЦР на матрице RnGalpha i1 -цитрин [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAACTCGCCGGCGTCATA-3′ и обратным праймером 5′-ATaccggtCGCGGTCATAAAGCCTTC. -3′.Для введения Age1-сайта в Gα i2 -цитрин мы провели полновекторную ПЦР на матрице HsGalpha i2 -цитрин [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAGGAGCAAGGCGTGCT-3′ и обратным праймером 5′-TAaccggtGGCGGTGCAGGACAGT. -3′. кДНК, содержащая кодирующую последовательность для HsGalpha i3 с сайтом Age1, была синтезирована компанией Eurofins (www.eurofins.nl). Разрезание продукта ПЦР mTq2 и новых векторов Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 с помощью Age1 и последующее лигирование привело к получению RnGalpha i1 , помеченного mTq2 после положения 121, и HsGalpha i2,6 90, помеченного с помощью Age1. mTq2 после положения 114, аналогично ранее описанному функционально меченому Gα i1,2,3 [20].

Для конструирования варианта 1.0 сенсора Gα i1 была проведена ПЦР на плазмиде mTq2-Gα i1 с прямым праймером 5′-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3′ и обратным праймером 5′-TATggatccAGCTTAGAAGAGACCACAGTC-3′ для введения Сайт BamHI на С-конце и сайт NcoI на N-конце. Затем проводили тройное лигирование с продуктом ПЦР (вырезанным BamHI и NcoI), вектором, содержащим pGβ 1 -T2A-cp173Venus-Gγ 2 [43] (вырезанным BamHI и SacII), и вектором, содержащим pPRIG. -IRES [44] (вырезано NcoI и SacII).Полученная плазмида, pGβ 1 -2A-YFP-Gγ 2 -IRES-MATT-Gα i1 -CFP, коэкспрессирует MATT-Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 (нарушение локализации в плазматической мембране), pGβ 1 и cp173Venus-Gγ 2 (рис. 1В).

Чтобы сконструировать вариант 2.0 сенсора Gα i1 , мы провели мутагенезную ПЦР с вариантом 1.0 в качестве матрицы путем амплификации с прямыми 5′-GAAAAACACGATGATAATATGGGCTGCACACTGAGC-‘3 и 5′-GCTCAGTGTGCAGCCCATATTATCGTGTTTTTC-3’. Полученная плазмида, pGβ 1 -2A-cp173Venus-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -mTurquoise2-Δ9, коэкспрессирует Gα i1 -mTq2 (правильно расположен на плазматической мембране), pGβ 1000 и cpVenus-Gγ 2 (рис. 1В).

Чтобы создать единый плазмидный сенсор для Gα i2 и Gα i3 , мы провели ПЦР с удлинением с перекрытием [45]. Gα i2 -mTq2 амплифицировали с прямым праймером ‘5-acgatgataatATGGGCTGCACCGTGA-3’ и обратным праймером ‘5-TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3’, а Gα i3 -mTq2 амплифицировали с прямым праймером ‘5-acgatgataatATGG3GCTG’CACG и обратным праймером праймер «5-TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3».Еще одну ПЦР проводили на ранее описанном [26] одиночном плазмидном Gα q -сенсоре с прямым праймером «5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3» и обратным праймером «5-GCAGCCCATattatcatcgtgtttttcaaag-3». Затем описанный выше продукт ПЦР Gα i2 -mTq2 или Gα i3 -mTq2 смешивали с продуктом ПЦР сенсора Gα q и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с прямым праймером ‘5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC. -3′ и обратный праймер ‘5-TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3’, а также прямой праймер ‘5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3’ и обратный праймер ‘5-TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3’ соответственно.Затем полученные продукты ПЦР лигировали в костяк сенсора Gα q с SacII и XbaI, в результате чего получали pGβ-2A-cp173Venus-Gγ 2 -IRES-Gα i2 -mTurquoise2-Δ9 и pGβ 1 — 2A-cp173Venus-Gγ2-IRES-Gα i3 -mTurquoise2-Δ9 соответственно. Последовательности плазмид доступны по запросу. Плазмиды будут распространяться через Addgene: http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/. RnGα i1 -mCitrine и HsGα i2 -mCitrine были любезным подарком Скотта Гибсона [20].Обратите внимание, что кодирующая последовательность RnGα i1 отличается только одной аминокислотой от последовательности Gα i1 человека (S98A). Рецептор LPA 2 был получен с сайта cDNA.org. Ранее были описаны BK 2 R [46], α 2 AR [21], M 3 R [47] и рецептор A1 [48]. β 2 AR-P2A-mCherry был любезным подарком от Анны Петрашевской (Университет Амстердама).

Культура клеток и подготовка образцов

Клетки

HeLa (Американская коллекция культур тканей: Манассас, Вирджиния, США) культивировали в Университете Амстердама (Амстердам, Нидерланды) с использованием модифицированной среды Игла Дульбекко (DMEM), снабженной глутамаксом, 10% FBS, пенициллином (100 ЕД/мл). ) и стрептомицин (100 мкг/мл).Все среды для культивирования клеток были получены от Invitrogen (Bleiswijk, NL).

Клетки трансфицировали в чашке диаметром 35 мм, содержащей покровное стекло диаметром 24 мм № 1 (Menzel-Gläser, Брауншвейг, Германия), используя 1–2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen), 0,5–1 мкг плазмидной кДНК и 50 мкл. OptiMeM (Life Technologies, Блейсвейк, Нидерланды). После инкубации в течение ночи при 37°C и 5% CO 2 покровные стекла помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen, Breda, NL) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (PH = 7. 4), 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCL, 1,8 мМ CaCL 2 , 0,8 мМ MgCl 2 и 20 мМ глюкозы). Всю микроскопию живых клеток проводили при 37°C.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были приобретены у Lonza и культивированы в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) на чашках, покрытых FN, в среде EGM-2 с добавлением одиночных клеток (Lonza, Вервье, Бельгия). HUVEC использовали при пассаже номер 4 или 5. В качестве метода трансфекции использовали систему трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и соответствующий набор для трансфекции Neon (Invitrogen).Генерировали одиночный импульс при 1300 В в течение 30 мс для микропорирования HUVEC с 2 мкг кДНК, затем клетки высевали на покровные стекла, покрытые FN.

Для быстрого кинетического измерения активации Gα i1 клетки HEK293 культивировали в Вюрцбургском университете (Вюрцбург, Германия) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глютамина (2 мМ) (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия), пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) и хранили при 37°С в атмосфере с 7% СО2. Клетки собирали и высевали на покрытые D-полилизином покровные стекла диаметром 24 мм при слиянии ~40%. Через три часа клетки временно трансфицировали 1,0 мкг рецептора (α 2 AR или аденозина A1) и 3,0 мкг pGβ 1 -2A-YFP-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -mTq2 кДНК на 6 -луночный планшет с реагентом для трансфекции Effectene ® (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Среду для выращивания обновляли через 24 часа, а измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов.Клетки содержали в среде для микроскопии (140 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, pH 7,3) и постоянно суперфузировали этим буфером или буфером, дополненным соответствующим лигандом, с использованием компьютеризированного устройство быстрой суперфузии, управляемое электромагнитным клапаном (ValveLink 8.2, Automate Scientific).

Широкопольная микроскопия

Ратиометрические измерения FRET в клетках HeLa (результаты представлены на рис. 2A, 2C и 2D) были выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH, Германия) в Университете Амстердама (Амстердам, Нидерланды), хранили при 37°С, снабжены масляным иммерсионным объективом (План-Неофлюор 40×/1.30; Carl Zeiss GmbH) и ксеноновой дуговой лампе с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK). Изображения были записаны с помощью охлаждаемой камеры устройства с зарядовой связью (Coolsnap HQ, Roper Scientific, Тусон, Аризона, США). Типичное время экспозиции варьировалось от 75 мс до 150 мс, а биннинг камеры был установлен на 4×4. Флуорофоры возбуждали светом с длиной волны 420 нм (ширина щели 30 нм) и отражали на образец с помощью дихроичного зеркала 455DCLP, эмиссию CFP регистрировали с помощью фильтра BP470/30, а эмиссию YFP регистрировали с помощью фильтра BP535/30, вращая колесо фильтров. .В экспериментах по совместной экспрессии YFP возбуждали светом с длиной волны 500 нм (ширина щели 30 нм) и отражали на образец с помощью дихроика 515DCXR, а эмиссию регистрировали с помощью фильтра BP535/30. Полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал и, для изображения отношения FRET, на просачивание эмиссии CFP в канале YFP ​​(55% интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для экспериментов FRET в HUVEC (результаты представлены на рис. 2B) в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) использовали микроскоп Zeiss Observer Z1 с числовой апертурой 40x 1.3 масляно-иммерсионным объективом и источником возбуждающего света HXP 120 В. CFP возбуждали через куб фильтра FRET (Exciter ET 436/20x и дихроичное зеркало 455 DCLP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США)). Излучение направлялось на присоединенный адаптер для двух камер (Carl Zeiss GmbH, Германия), управляющий дихроичным зеркалом 510 DCSP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США). Волны излучения в диапазоне 455–510 нм направляются на эмиссионный фильтр ET 480/40 (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США), а затем фиксируются камерой Hamamatsu ORCA-R2.Излучение с длиной волны 510 нм и выше направляется на эмиссионный фильтр ET 540/40m (Ludl Electronic Products, Нью-Йорк, США) и затем захватывается второй камерой Hamamatsu ORCA-R2. Получение изображений было выполнено с использованием программного обеспечения микроскопа Zeiss-Zen 2011. Все полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал. Полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал и просачивание излучения CFP в канале YFP ​​(62% интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для быстрых кинетических измерений активации Gα i1 (результаты представлены на рис. 3) визуализацию выполняли на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 в Вюрцбургском университете (Вюрцбург, Германия), оснащенном масляным иммерсионным объективом с увеличением 63x и двухэмиссионная фотометрическая система (Till Photonics), как описано ранее [21].Трансфицированные клетки возбуждали светом полихрома IV (Till Photonics). Освещение было установлено на 40 мс из общего времени интеграции 100 мс. Сигналы CFP (480 ± 20 нм), YFP (535 ± 15 нм) и отношения FRET (YFP/CFP) регистрировали одновременно (светоделитель DCLP 505 нм) при возбуждении на 436 ± 10 нм (светоделитель DCLP 460 нм). Сигналы флуоресценции регистрировали фотодиодами и оцифровывали с помощью аналого-цифрового преобразователя (Digidata 1440A, Axon Instruments). Все данные были записаны на ПК под управлением Clampex 10.3 программного обеспечения (Axon Instruments). Полученные отдельные трассы были приспособлены к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания для извлечения экспоненциальной постоянной времени, тау [39]. Полупериод активации (t 1/2 ) определяется как τ*ln2. В динамических экспериментах клетки стимулировали UK14,304 (10 мкМ), йохимбином (60 мкМ), брадикинином (1 мкМ), LPA (1 мкМ), карбахолом (100 мкМ), атропином (10 мкМ), изопротеренолом (10 мкМ), пропранололом (10 мкМ), S1P (500 нМ), 20 мкМ или 100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина в указанные моменты времени.ImageJ (Национальный институт здравоохранения) использовался для анализа необработанных микроскопических изображений. Дальнейшая обработка данных проводилась в Excel (Microsoft Office), а графики и статистика проводились с использованием Graphpad версии 6. 0 для Mac, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com.

Конфокальная микроскопия

клетки HeLa, трансфицированные указанными конструкциями, визуализировали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1, оснащенного масляным иммерсионным объективом с увеличением 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер пинхола был установлен на 1 единицу Эйри (<0,8 мкм).

Образцы последовательно возбуждались лазерной линией 457 нм и 514 нм и отражались на образец дихроичным зеркалом 457/514. Эмиссия CFP фильтровалась через фильтр эмиссии BP482/35; Эмиссия YFP фильтровалась через эмиссионный фильтр BP540/30. Во избежание просачивания изображения были получены в режиме последовательного строчного сканирования. Все полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал.

Благодарности

Мы благодарим Eelco Hoogendoorn (Амстердамский университет) и Marten Postma (Амстердамский университет) за помощь в анализе данных.Мы благодарим Йоррита Броертьеса (студента магистра наук Амстердамского университета) и Денниса Ботмана (студента магистра наук Амстердамского университета) за создание Gα i1 -mTurquoise2 и Gα i2 -mTurquoise2 соответственно. Мы благодарим Мерел Аджобо-Херманс, Анну Петрашевскую и Скотта Гибсона за предоставление плазмид.

Вклад авторов

Задумал и разработал эксперименты: JvU PLH CH JG TWG. Выполнены опыты: JvU ADS BS NRR. Проанализированы данные: JvU ADS BS NRR CH JG.Написал статью: JvU ADS BS NRR PLH CH TWG JG.

Каталожные номера

  1. 1. Суки В.Н., Абрамовиц Дж., Маттера Р., Кодина Дж., Бирнбаумер Л. Геном человека кодирует по крайней мере три неаллельных G-белка с субъединицами альфа-i-типа. ФЭБС лат. 1987; 220: 187–192. пмид:2440724
  2. 2. Кимпл М.Э., Нойман Дж.К., Линнеманн А.К., Кейси П.Дж. Ингибирующие G-белки и их рецепторы: новые терапевтические мишени при ожирении и диабете. Эксп Мол Мед. 2014;46: e102. пмид:24946790
  3. 3.Ван Ю, Ли Ю, Ши Г. Регулирующая функция гетеротримерных G-белков в иммунной системе. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2013; 61: 309–319.
  4. 4. Дорсам РТ, Гуткинд Дж.С. Рецепторы, связанные с G-белком, и рак. Нат Рев Рак. 2007;7: 79–94. пмид:17251915
  5. 5. Белки Daaka Y. G при раке: парадигма рака предстательной железы. наук СТКЭ. 2004; 2004: вып.2. пмид:14734786
  6. 6. Appleton KM, Bigham KJ, Lindsey CC, Hazard S, Lirjoni J, Parnham S, et al.Разработка ингибиторов гетеротримерных субъединиц Gαi. Биоорг Мед Хим. 2014; 22: 3423–3434. пмид:24818958
  7. 7. Рэймонд Дж. Р., Эпплтон К. М., Пирс Дж. Ю., Петерсон Ю. К. Подавление сообщения GNAI2 при раке яичников. J Яичник Res. 2014;7:6. pmid:24423449
  8. 8. Гарсия А., Ким С., Бхавараю К., Шенвальдер С.М., Кунапули С.П. Роль фосфоинозитид-3-киназы бета в агрегации тромбоцитов и образовании тромбоксана А2, опосредованная сигнальными путями Gi. Биохим Дж.2010; 429: 369–377. пмид:20441566
  9. 9. Ла Сала А., Гадина М., Келсолл Б.Л. Зависимое от G(i)-белка ингибирование продукции IL-12 опосредовано активацией пути фосфатидилинозитол-3-киназа-протеин-3-киназа B/Akt и JNK. Дж Иммунол. 2005; 175: 2994–2999. пмид:16116186
  10. 10. Kue PF, Daaka Y. Существенная роль G-белков в росте клеток рака предстательной железы и передаче сигналов. Дж Урол. 2000; 164: 2162–2167. пмид:11061948
  11. 11. Хур Э.М., Ким К.Т.Передача сигналов рецептора, связанного с G-белком, и перекрестные помехи: достижение скорости и специфичности. Сотовый сигнал. 2002; 14: 397–405. пмид:11882384
  12. 12. Брюс ДЖИ, Штрауб С.В., Юл Д.И. Перекрестные помехи между сигналами цАМФ и Ca2+ в невозбудимых клетках. Клеточный кальций. 2003; 34: 431–444. пмид:14572802
  13. 13. Фей Д., Краучер Д.Р., Колх В., Холоденко Б.Н. Перекрестные помехи и сигнальные переключатели в каскадах митоген-активируемых протеинкиназ. Фронт Физиол. 2012;3: 355. pmid:23060802
  14. 14.Лохсе М.Дж., Нубер С., Хоффманн С. Методы резонансной передачи энергии флуоресценции/биолюминесценции для изучения активации и передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белком. Pharmacol Rev. 2012; 64: 299–336. пмид:22407612
  15. 15. Ван Унен Дж., Вулард Дж., Ринкен А., Хоффманн С., Хилл С., Годхарт Дж. и др. Перспектива изучения передачи сигналов GPCR с помощью биосенсоров RET в живых организмах. Мол Фармакол. 2015;88(3): 589–595.
  16. 16. Gales C, Van Durm JJJ, Schaak S, Pontier S, Percherancier Y, Audet M, et al.Исследование структурных перестроек, вызванных активацией, в предварительно собранных комплексах рецептор-G-белок. Nat Struct Mol Biol. 2006; 13: 778–786. пмид:168
  17. 17. Gales C, Rebois RV, Hogue M, Trieu P, Breit A, Hébert TE, et al. Мониторинг взаимодействия рецепторов и G-белков в живых клетках в режиме реального времени. Нат Методы. 2005;2: 177–184. пмид:15782186
  18. 18. Аюб М.А., Морел Д., Бине В., Финк М., Презо Л., Ансанай Х. и др. Анализ в режиме реального времени индуцированной агонистом активации активируемого протеазой рецептора 1/Galphai1 белкового комплекса, измеренной с помощью резонансного переноса энергии биолюминесценции в живых клетках. Мол Фармакол. 2007; 71: 1329–1340. пмид:17267663
  19. 19. Сольер А., Беллот М., Пэрис Х., Денис С., Финана Ф., Хансен Дж. Т. и др. Расшифровка сложности предвзятого агонизма выявляет новый активный объект рецептора AT1. Nat Chem Biol. Издательская группа «Природа»; 2012;8: 623–631.
  20. 20. Гибсон СК, Гилман АГ. Субъединицы Giα и Gβ определяют селективность активации G-белка α2-адренорецепторами. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2006; 103: 212.
  21. 21. Бюнеманн М., Франк М., Лозе М.Дж. С обложки: Активация белка Gi в интактных клетках включает перестройку субъединиц, а не диссоциацию. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2003;100: 16077.
  22. 22. Klarenbeek JB, Goedhart J, Hink MA, Gadella TWJ, Jalink K. Датчик цАМФ на основе mTurquoise как для FLIM, так и для логометрического считывания имеет расширенный динамический диапазон. ПЛОС ОДИН. 2011;6: e19170. пмид:21559477
  23. 23. Спарта Б., Паргетт М., Минге М., Дистор К., Белл Г., Альбек Дж.Г.Механизмы на уровне рецепторов необходимы для импульсов активности киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), стимулируемой эпидермальным фактором роста (EGF). Дж. Биол. Хим. 2015; 290: 24784–24792. пмид:26304118
  24. 24. Hamers D, van Voorst Vader L, Borst JW, Goedhart J. Разработка биосенсоров FRET для систем млекопитающих и растений. Протоплазма. 2014; 251: 333–347. пмид:24337770
  25. 25. Goedhart J, Stetten von D, Noirclerc-Savoye M, Lelimousin M, Joosen L, Hink MA, et al.Структурно-управляемая эволюция голубых флуоресцентных белков с квантовым выходом 93%. Связь с природой. 2012;3: 751. pmid:22434194
  26. 26. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al. Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. БМС Биол. 2011;9:32. pmid:21619590
  27. 27. Гоэдхарт Дж. , Ван Верен Л., Аджобо-Херманс М.Дж.В., Эльзенаар И., Хинк М.А., Гаделла Т.В.Дж. Количественная коэкспрессия белков на уровне отдельных клеток – приложение к мультимерному датчику FRET.Дельпрато AM, редактор. ПЛОС ОДИН. 2011;6: e27321. пмид:22114669
  28. 28. Бернс ДЛ. Субъединичная структура и ферментативная активность коклюшного токсина. микробиол. наук. 1988; 5: 285–287. пмид: 28
  29. 29. Wang F, Van Brocklyn JR, Hobson JP, Movafagh S, Zukowska-Grojec Z, Milstien S, et al. Сфингозин-1-фосфат стимулирует миграцию клеток через G(i)-связанный рецептор клеточной поверхности. Возможное участие в ангиогенезе. Дж. Биол. Хим. 1999; 274: 35343–35350. пмид:10585401
  30. 30.Ляо Дж. К., Хомси С. Дж. Белки G семейства G альфа i и G альфа q связывают рецептор брадикинина с высвобождением эндотелиального релаксирующего фактора. Джей Клин Инвест. 1993; 92: 2168–2172. пмид:8227332
  31. 31. ван Корвен Э.Дж., Грунинк А., Ялинк К., Эйхгольц Т. , Муленаар В.Х. Лизофосфатидат-индуцированная пролиферация клеток: идентификация и анализ сигнальных путей, опосредованных G-белками. Клетка. 1989; 59: 45–54. пмид:2551506
  32. 32. An S, Bleu T, Hallmark OG, Goetzl EJ.Характеристика нового подтипа рецептора лизофосфатидной кислоты, связанного с G-белком человека. Дж. Биол. Хим. 1998; 273: 7906–7910. пмид:9525886
  33. 33. Офферманнс С., Виланд Т., Хоманн Д., Сандманн Дж., Бомбьен Э., Спичер К. и др. Трансфицированные мускариновые ацетилхолиновые рецепторы избирательно связываются с G-белками Gi-типа и Gq/11. Мол Фармакол. 1994; 45: 890–898. пмид:81
  34. 34. Акам EC, Challiss RA, Nahorski SR. Профили активации G(q/11) и G(i/o) в клетках СНО, экспрессирующих человеческие мускариновые ацетилхолиновые рецепторы: зависимость от агониста, а также от подтипа рецептора.Бр Дж. Фармакол. 2001; 132: 950–958. пмид:11181437
  35. 35. Хорниголд Д.С., Мистри Р., Раймонд П.Д., Бланк Дж. Л., Чаллисс Р.Дж. Доказательства перекрестного взаимодействия между мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами M2 и M3 в регуляции путей передачи сигналов вторичных мессенджеров и киназ, регулируемых внеклеточными сигналами, в клетках яичников китайского хомячка. Бр Дж. Фармакол. 2003; 138: 1340–1350. пмид:12711635
  36. 36. Блаукат А., Барак А., Кросс М.Дж., Офферманнс С., Дикич И. Активация протеинкиназы, активируемой митоген-активируемой протеинкиназой, опосредованной рецептором, связанным с G-белком, посредством взаимодействия сигналов Galpha(q) и Galpha(i).Молекулярная и клеточная биология. 2000; 20: 6837–6848. пмид:10958680
  37. 37. Йонгсма М., Матас-Рико Э., Рзадковски А., Джалинк К., Муленаар В.Х. LPA является химиопеллентом для клеток меланомы B16: действие через цАМФ-повышающий рецептор LPA5. ПЛОС ОДИН. 2011;6: e29260. пмид:22195035
  38. 38. Хилл С.Дж., Бейкер Дж.Г. Взлеты и падения переключения Gs-белка на Gi. Бр Дж. Фармакол. 2003; 138: 1188–1189. пмид:12711616
  39. 39. Хоффманн С., Гайетта Г., Бюнеманн М., Адамс С.Р., Обердорф-Маасс С., Бер Б. и др.Подход FRET на основе FlAsH для определения активации рецептора, связанного с G-белком, в живых клетках. Нат Методы. 2005;2: 171–176. пмид:15782185
  40. 40. Хайн П., Роше Ф., Хоффманн С., Дорш С., Николаев В.О., Энгельхардт С. и др. Активация GS ограничена по времени в инициации опосредованной рецептором передачи сигналов. Журнал биологической химии. 2006; 281: 33345–33351. пмид:16963443
  41. 41. Хоффманн С., Нубер С., Забель У., Циглер Н., Винклер С., Хайн П. и др. Сравнение кинетики активации М3-АХ-рецептора и конститутивно-активного мутантного рецептора в живых клетках.Мол Фармакол. 2012;82(2): 236–245 п.м.:22564786
  42. 42. Деванатан В., Хагедорн И., Келер Д., Пекса К., Черпокова Д., Крафт П. и др. Белок Gi тромбоцитов Gαi2 является важным медиатором тромбовоспалительного повреждения органов у мышей. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112: 6491–6496. пмид:25944935
  43. 43. Нагаи Т., Ямада С., Томинага Т., Итикава М., Мияваки А. Расширенный динамический диапазон флуоресцентных индикаторов для Ca (2+) с помощью желтых флуоресцентных белков с круговой перестановкой.Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 10554–10559. пмид:15247428
  44. 44. Martin P, Albagli O, Poggi MC, Boulukos KE, Pognonec P. Разработка нового бицистронного ретровирусного вектора с сильной активностью IRES. БМС Биотехнология. 2006;6:4. pmid:16409632
  45. 45. Хекман К.Л., Пиз Л.Р. Сплайсинг генов и мутагенез путем удлинения перекрывания, управляемого ПЦР. Нат Проток. 2007; 2: 924–932. пмид:17446874
  46. 46. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, Gadella TWJ.Регуляция закрепления мембраны PLCbeta1a ее субстратом фосфатидилинозитол (4,5)-бисфосфатом. Журнал клеточной науки. 2008; 121: 3770–3777. пмид:18957514
  47. 47. Ziegler N, Bätz J, Zabel U, Lohse MJ, Hoffmann C. Датчики на основе FRET для человеческих M1-, M3- и M5-ацетилхолиновых рецепторов. Биоорг Мед Хим. 2011;19: 1048–1054. пмид:20716489
  48. 48. Клотц К.Н., Хесслинг Дж., Хеглер Дж., Оуман С., Кулл Б., Фредхольм Б.Б. и др. Сравнительная фармакология подтипов аденозиновых рецепторов человека — характеристика стабильно трансфицированных рецепторов в клетках CHO.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1998; 357: 1–9. пмид:9459566

Сенсоры FRET нового поколения для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в одиночных клетках

Резюме

Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), могут активировать гетеротримерный комплекс G-белка с субсекундной кинетикой. Генетически кодируемые биосенсоры, основанные на переносе энергии резонанса Фёрстера (FRET), идеально подходят для изучения таких быстрых сигнальных событий в отдельных живых клетках.Здесь мы сообщаем о конструкции и характеристике трех биосенсоров FRET для измерения активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 . Чтобы обеспечить количественную долгосрочную визуализацию биосенсоров FRET с высоким динамическим диапазоном, необходимы флуоресцентные белки с улучшенными фотофизическими свойствами. Поэтому в качестве донора, слитого с субъединицей Gα и , мы используем самый яркий и фотостабильный на данный момент вариант CFP, mTurquoise2, а в качестве акцептора cp173Venus, слитый с субъединицей Gγ 2 .Конструкции биосенсоров Gα и FRET экспрессируются вместе с Gβ 1 из одной плазмиды, обеспечивая предпочтительные относительные уровни экспрессии с уменьшенной изменчивостью в клетках млекопитающих. Сенсоры Gα и FRET продемонстрировали устойчивый ответ на активацию эндогенных или гиперэкспрессированных альфа-2А-адренорецепторов, которая ингибировалась коклюшным токсином. Кроме того, мы наблюдали активацию сенсора Gα и FRET в одиночных клетках при стимуляции нескольких GPCR, включая рецепторы LPA 2 , M 3 и BK 2 . Кроме того, мы показываем, что датчики хорошо подходят для извлечения кинетических параметров из быстрых измерений в миллисекундном временном диапазоне. Это новое поколение биосенсоров FRET для активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 будет полезно для измерений живых клеток, которые исследуют активацию Gα i .

Введение

Подкласс гетеротримерных G-белков Gα и состоит из 3 членов у человека, Gα i1,2,3 кодируется генами GNAI1, GNAI2, GNAI3 [1] и активируется широким спектром рецепторов, связанных с G-белком.Семейство Gα и G-белков вовлечено в многочисленные патологии, от участия в ожирении и диабете [2], функций в иммунной системе [3] до их критических ролей на нескольких стадиях биологии рака [4–7]. . Активация Gα и преимущественно связана с ингибированием аденилатциклаз, что приводит к снижению накопления цАМФ в клетках. Однако активация Gα и совсем недавно была связана с несколькими другими молекулярными эффекторами, включая PI3K/Akt [8,9], ERK [10] и c-Src [5].

Измерение активации Gα и обычно проводится путем измерения ингибирования индуцированной форсколином продукции цАМФ. Подобно анализам фосфорилирования, расположенным ниже по течению, такие измерения не имеют пространственного разрешения, имеют ограниченное временное разрешение и могут зависеть от значительных перекрестных помех и усиления или десенсибилизации сигнала [11-13].

Для прямого исследования активации G-белка с высоким пространственно-временным разрешением можно использовать генетически кодируемые биосенсоры FRET (Förster Resonance Energy Transfer) или BRET (Bioluminescent Resonance Energy Transfer) [14].Эти методы основаны на измерении безызлучательной передачи энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору, которая имеет место только тогда, когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости друг от друга (<10 нм). Изменения расстояния или ориентации между донорным и акцепторным диполем приводят к изменениям эффективности RET, которые можно измерить количественно.

Методы RET позволяют регистрировать кинетику отдельных клеток с разрешением в миллисекунды, что можно использовать для выявления межклеточной гетерогенности и записи фармакокинетических параметров.Более того, этот подход может регистрировать активацию GPCR в физиологических условиях in vivo [15].

Gα i были успешно помечены люциферазой в различных внутренних сайтах и ​​использованы для измерений BRET между различными субъединицами Gα i и GPCR [16–19] или Gγ [19]. Также были выполнены измерения FRET между флуоресцентно меченными Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 и Gβ [20] или Gγ [21].

Для выполнения измерений FRET необходима спектрально перекрывающаяся пара донора и акцептора [24], и ранее было показано, что использование более ярких флуоресцентных белков может улучшить чувствительность измерений биосенсора FRET [22,23].Чтобы получить надежные измерения FRET, которые исследуют активацию Gα i , мы сделали слияние Gα i1 Gα i2 и Gα i3 с самым ярким и наиболее фотостабильным мономерным голубым флуоресцентным белком (CFP), доступным в настоящее время, mTurquoise2. (mTq2) [25]. В качестве акцептора мы использовали кольцевую пермутантную Венеру (cpVenus), слитую с Gγ 2 , которая ранее использовалась в качестве акцептора в одиночном плазмидном сенсоре Gα q FRET [26]. Мы используем единую плазмидную стратегию, чтобы облегчить протоколы трансфекции и обеспечить четко определенное соотношение экспрессии донора и акцептора в клетках [27].Эта стратегия выражения должна значительно облегчить использование и воспроизводимость результатов этих датчиков. Мы представляем стратегию построения, проверку и характеристику этого нового поколения датчиков FRET для активации Gα i1 Gα i2 и Gα i3 . Эти биосенсоры очень хорошо подходят для микроскопии живых клеток и могут использоваться для быстрых кинетических измерений в миллисекундном диапазоне, что позволяет характеризовать фармакологические препараты и определять включение и выключение кинетики агонистов и антагонистов Gα и -связанных GPCR.

Результаты

Генерация конструкций

Мономерный вариант CFP mTurquoise2, предпочтительный донор в парах CFP-YFP FRET из-за его высокого квантового выхода и фотостабильности [25], был вставлен в Gα i1 после аланина в положении 121 в петле αB-αC. Ранее было показано, что этот сайт встраивания сохраняет нуклеотидный обмен и скорость реакции GTPase, сравнимую с белком дикого типа [20]. Gα i1 -mTq2 проявляет локализацию в плазматической мембране при экспрессии в клетках HeLa (4).Были проведены пробные эксперименты, чтобы проверить, подходит ли Gα i1 -mTq2 для измерения с помощью FRET активации гетеротримерного комплекса G-белка при активации GPCR. С этой целью как Gβ, так и Gγ могут быть помечены акцептором для измерения активации гетеротримерного G-белка с помощью FRET [20,21]. Ранее мы показали, что самый высокий контраст FRET для Gα q достигается с cpVenus-Gγ 2 [26]. Поскольку Gα i имеет высокую структурную гомологию с Gα q , а сайт, в который вставляется mTurquoise2, аналогичен, мы решили использовать здесь тот же акцептор FRET. Поэтому для введения в клетки меченого гетеротримерного комплекса G-белка мы коэкспрессировали Gα i1 -mTq2 вместе с акцептором FRET cpVenus-Gγ 2 и немеченым Gβ 1 [26]. Стимуляция коэкспрессированного адренергического рецептора α 2 (α 2 AR) с помощью UK14,304 показывает быстрое увеличение флуоресценции CFP и сопутствующую потерю сенсибилизированной эмиссии из канала YFP, что отражает потерю FRET. Утрату FRET можно интерпретировать как диссоциацию гетеротримера или изменение относительной конформации донора и акцептора.Чтобы обеспечить надежную совместную экспрессию различных компонентов мультимерного сенсора FRET, мы ввели субъединицы в одну и ту же плазмиду, как мы сообщали ранее для сенсора Gα q () [26]. Эта стратегия использует вирусный пептид 2A и последовательность IRES для обеспечения оптимальных относительных уровней донора (Gα i1 -mTq2) и акцептора (cpVenus-Gγ 2 ) в отдельных клетках, минимизируя гетерогенность межклеточной экспрессии. в образце. После создания нашего первого варианта мы заметили, что Gα i1 -mTq2 был неправильно локализован в цитоплазме во многих клетках ().Субъединица Gα i1 миристоилирована и требует остатка глицина сразу после исходного метионина. Детальное исследование плазмидной последовательности выявило дополнительный стартовый кодон для Gα i1 -mTq2 выше нативного стартового кодона, генерируемый последовательностью IRES (4). Мы предположили, что в нашем первом варианте сенсора большая часть продуцируемого белка Gα i1 -mTq2 была транслирована с вышестоящего метионина в последовательности IRES, что не приводит к миристоилированному белку.Мы удалили восходящий метионин с помощью полновекторной ПЦР (см. Материалы и методы), которая оставляет только нативный стартовый кодон Gα i1 -mTq2, за которым следует глицин, обеспечивающий консенсусную последовательность для миристоилирования. Действительно, после трансфекции клеток новой плазмидой мы наблюдали правильно локализованные Gα i1 -mTq2 (). Аналогичным образом были сконструированы датчик Gα i2 и датчик Gα i3 . Чтобы изучить совместную экспрессию трех субъединиц (Gα i1 -mTq2, Gβ 1 и cpVenus-Gγ 2 ) из одной плазмиды по сравнению с тремя отдельными плазмидами, мы количественно оценили флуоресценцию CFP и YFP в этих двух экспериментальных условия ().Флуоресценция CFP и YFP в стратегии трансфекции с одной плазмидой имела коэффициент детерминации r 2 , равный 0,64, тогда как трансфекции тремя отдельными плазмидами показали коэффициент детерминации r 2 , равный 0,36, между интенсивностью CFP и интенсивностью YFP. Другими словами, корреляция между экспрессией CFP и YFP лучше в конфигурации с одной плазмидой, что указывает на явное преимущество этой конструкции. Дополнительным преимуществом этой плазмиды является экспрессия белка 3:1 выше и ниже последовательности IRES, что, как было показано ранее, приводит к предпочтительному соотношению экспрессии донора (CFP) и акцептора (YFP) для аналогичного Gα q FRET. датчик [27].Наконец, конструкции с одной плазмидой упростят введение в первичные клетки, создание стабильных клеточных линий или трансгенных организмов с Gα i -сенсорами.

Разработка и характеристика нового датчика Gα i1 .

(A) Репрезентативное изображение, показывающее локализацию на плазматической мембране Gα i1 , слитого с mTurquoise2-Δ9, экспрессированного в клетках HeLa. (B) Схематический обзор плазмиды, содержащей pGβ-2A-YFP-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -CFP, управляемой промотором CMV.На вставке показана последовательность ДНК, кодирующая конец последовательности IRES и начало последовательности Gα i1 . Предлагаемая трансляция белка показана в строке ниже последовательности ДНК (однобуквенные сокращения аминокислот). (C) Конфокальные изображения локализации Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 ( верхний ряд ) и cp173Venus-Gγ 2 ( нижний ряд ) в клетках HeLa, для варианта 1. 0 ( левый столбец ) и вариант 2.0 ( правая колонка ) датчика Gα i1 .(D) Количественный анализ коэкспрессии каналов CFP и YFP трансфекций cp173Venus-Gγ 2 и Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 в клетках HeLa. Трансфекция одной плазмидой ( слева ) по сравнению с трансфекцией отдельными плазмидами ( справа ). Точки изображают интенсивность CFP и YFP, количественно определяемую по отдельным одиночным клеткам. r 2 – коэффициент детерминации. Ширина отдельных изображений в A и C составляет 143 мкм.

Эффективность в анализах активации GPCR

Для тестирования нового биосенсора Gα i1 в визуализации живых клеток мы использовали хорошо изученный GPCR, который, как известно, связывается с Gα i1 , адренергическим рецептором α 2 (α рецептор АР).Клетки HeLa, для которых ранее было показано, что они эндогенно содержат α 2 AR [20], трансфицировали биосенсором Gα i1 . При добавлении 10 мкМ UK14,304 мы наблюдали устойчивую потерю FRET, измеряя соотношение между флуоресценцией YFP и CFP биосенсора Gα i1 , которое возвращалось к исходному уровню при добавлении 60 мкМ α 2 AR. антагонист Йохимбин (). Было показано, что коклюшный токсин (PTX) инактивирует передачу сигналов Gα и в клетках посредством АДФ-рибозилирования субъединицы Gα i [28], что предотвращает ее взаимодействие с GPCR.Активация Gα i1 полностью прекращалась при инкубации в течение ночи с PTX, показывая, что слитый белок Gα i1 -mTq2 по-прежнему чувствителен к PTX (). Чтобы подтвердить, что датчик можно использовать для анализа активации Gα i1 эндогенных рецепторов в первичных клетках, мы повторили этот эксперимент в HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека). Добавление хорошо известного стимулятора HUVEC, S1P [29], вызывало устойчивое снижение отношения FRET Gα i1 -сенсора (), ночная обработка PTX полностью отменяла этот ответ. Затем, чтобы исследовать, насколько надежно датчик Gα i1 работает в других анализах активации GPCR, мы протестировали множество GPCR, которые, как было показано, связываются с Gα i . Рецептор брадикинина 2B (BK 2B ) [30], рецептор лизофосфатидной кислоты 2 (LPA 2 ) [31, 32] и рецептор мускаринового ацетилхолина 3 (M 3 ) [33, 34] котрансфицировали с биосенсор Gα i1 в клетках HeLa. При стимуляции соответствующими агонистами все три рецептора показали устойчивое снижение коэффициента FRET биосенсора Gα i1 ().Рецептор M 3 также показал полное восстановление отношения FRET до исходного уровня после добавления антагониста атропина. Рецептор M 3 в основном известен своей передачей сигналов через Gα q . Тем не менее, предыдущие исследования показали активацию Gα i через рецептор M 3 [19,33–36], что соответствует нашим наблюдениям.

Характеристики датчиков Gα и в анализах передачи сигналов GPCR в одиночных клетках.

(A) Эксперименты по визуализации соотношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα i1 .Быстрая потеря FRET, наблюдаемая по уменьшению отношения YFP/CFP, после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, специфичного агониста α 2 AR, добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка РТХ (100 нг/мл) устраняет ответ на Gα i1 -сенсор в клетках, стимулированных UK-14304. (B) Эксперименты по визуализации соотношения FRET у Huvecs, трансфицированных датчиком Gα i1 . Устойчивая потеря FRET наблюдается после стимуляции 500 нМ S1P (сфингозин-1-фосфат).Ночная обработка РТХ (100 нг/мл) устраняет ответ на Gα i1 -сенсор в клетках, стимулированных S1P. (C) Эксперименты с визуализацией отношения FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gα i1 и BK 2B ( вверху справа ), LPA 2 ( вверху слева ), M 3 ( внизу справа ) и β 2 AR-2A2-mCherry ( внизу слева ) стимулировали 1 мкМ брадикинина (BK 2B ), 1 мкМ лизофосфатидной кислоты (LPA 1 мкМ 2 6), (M 3 ) или 10 мкМ изопротеренола и 10 мкМ пропранолола (β 2 AR). Клетки HeLa, трансфицированные рецепторами BK 2B , LPA 2 и M 3 , демонстрируют четкое изменение соотношения YFP/CFP FRET при добавлении соответствующих агонистов, тогда как стимуляция β 2 AR не изменяет FRET. отношение датчика Gα i1 . В контрольных условиях клетки HeLa с трансфицированным только Gα i1 сенсором получали идентичные стимуляции. (D) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα i2 или датчиком Gα i3 .Быстрая потеря FRET наблюдается после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, последующее добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка коклюшным токсином (PTX) (100 нг/мл) устраняет ответ биосенсоров Gα i2 и Gα i3 в клетках, стимулированных UK-14304. Клетки HeLa стимулировали агонистом при t = 32 с, а антагонист добавляли при t = 152 с, где указано. Клетки Huvec стимулировали S1P при t = 55 с.Кривые времени показывают среднее изменение соотношения флуоресценции YFP/CFP (± sem). Средние кривые состоят из данных не менее 3 независимых экспериментов, проведенных в разные дни, с указанным числом клеток ( n ) на условие.

В контрольных условиях, т.е. В отсутствие сверхэкспрессии GPCR мы стимулировали клетки HeLa соответствующими агонистом и антагонистом и наблюдали лишь очень незначительный ответ на сенсоре Gα i1 в случае стимуляции LPA. Скорее всего, это связано с активацией эндогенных LPA-рецепторов в клетках HeLa [37].Когда мы совместно трансфицировали адренергический рецептор β 2 (β 2 AR), ни одна из клеток не показала активации Gα i1 в ответ на лечение агонистом и антагонистом (). Следует отметить, что β 2 AR является классическим активатором Gα s , но при определенных условиях сообщалось о переключении на Gα i [38]. Наши результаты согласуются с единственным известным нам исследованием, в котором используются аналогичные инструменты (сенсоры на основе BRET) и аналогичные условия (сверхэкспрессированные β 2 AR и гетеротримерные сенсоры G-белка) [19].Также в этом случае не наблюдалось активации Gα i1 при стимуляции β 2 AR (и лишь незначительная активация Gα i2 и Gα i3 , которая была более чем в 10 раз ниже, чем активация альфа-2C). адренергический рецептор, сильный активатор Gα i ).

Чтобы проверить работу биосенсоров Gα i2 и Gα i3 , мы трансфицировали клетки HeLa соответствующими плазмидами. Подобно эксперименту с биосенсором Gα i1 , мы наблюдали сильную потерю FRET после добавления 10 мкМ UK14,304, а сигнал возвращался к исходному уровню после добавления 60 мкМ йохимбина ().В этих экспериментальных условиях мы не наблюдали существенных различий в кинетике активации или амплитуде ответов между тремя различными субъединицами Gα и . Как Gα i2 -mTq2, так и Gα i3 -mTq2 по-прежнему чувствительны к лечению PTX, о чем свидетельствует исчезновение ответа FRET после инкубации в течение ночи с PTX ().

Быстрые кинетические измерения

Для более детального изучения кинетики активации Gα i1 в живых клетках за доли секунды клетки HEK293 котрансфицировали с помощью сенсора Gα i1 и α 2 . AR или аденозиновый рецептор A1 соответственно.Используя систему быстрой перфузии для нанесения лиганда, измерения FRET в одиночных клетках показывают быструю потерю коэффициента FRET более чем на 15% после кратковременного применения 20 мкМ норэпинефрина. После вымывания лиганда сигнал FRET возвращается к базовым уровням. Это можно было воспроизвести несколько раз без заметной потери амплитуды сигнала (). Сходный ответ наблюдался для аденозинового рецептора A1 после кратковременного применения эндогенного лиганда аденозина (30 мкМ) ().

Характеристики датчика Gα i1 при кинетических измерениях.

(A) Клетки HEK293, трансфицированные Gα i1 -сенсором и α 2 AR, неоднократно стимулировали 20 мкМ норадреналина в течение интервалов, которые обозначены короткими горизонтальными линиями. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированное и нормализованное отношение FRET. (B) Клетки HEK293, трансфицированные Gα i1 -сенсором и аденозиновым A1-рецептором, стимулировали 30 мкМ аденозина, что обозначено короткой горизонтальной линией.Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированное и нормализованное отношение FRET. (C) Крупный план он-кинетики активации Gα i1 , показывающий нормализованное отношение FRET во время первой стимуляции эксперимента в (A), приспособленное к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания с tau = 1160 мс и амплитудой = 0,18 (R = 0,99). (D) Диаграмма рассеяния, показывающая средние экспоненциальные константы времени (tau) объединенных данных из (n = 10) отдельных подборок клеток HEK293, трансфицированных датчиком Gα i1 , и AR α 2 , стимулированных 100 мкМ норадреналина или объединенных данные (n = 14) из отдельных подходов датчика Gα i1 и аденозинового A1-рецептора, стимулированного 30 мкМ аденозина, соответственно.Столбики погрешностей указывают на 95% ДИ.

Эти быстрые измерения FRET можно использовать для оценки он-кинетики активации Gα i1 с разрешением менее секунды (), как показано крупным планом первой стимуляции в эксперименте, показанном на . Кривая была подогнана под однокомпонентную экспоненциальную функцию затухания, как описано ранее [39], в результате чего экспоненциальная постоянная времени (τ) составила 1160 мс.

Для оценки точной кинетики скорости включения Gα i1 -сенсора клетки стимулировали насыщающими концентрациями лиганда (100 мкМ норадреналина или 30 мкМ аденозина). Каждый отдельный ответ был подогнан под однокомпонентную экспоненту, что привело к средним значениям τ для α 2 AR, равным 887 мс, и для аденозина A1, равному 963 мс (), что соответствует времени полураспада 614 мс и 668 мс соответственно. Эти значения хорошо согласуются с более ранними наблюдениями за активацией G-белка с помощью FRET [21,40,41].

Заключительные замечания

В этой рукописи мы описываем дизайн, конструкцию и характеристики трех новых биосенсоров FRET для измерения активации Gα i1 , Gα i2 , Gα i3 .Новые сенсоры содержат субъединицу Gα, слитую с донорным флуорофором, mTurquoise2, и субъединицу Gγ, слитую с cp173Venus, поскольку ранее было показано, что эта комбинация для сенсора Gα q FRET обеспечивает наибольший динамический диапазон [26]. Три субъединицы гетеротримера (Gα i -mTq2, Gβ 1 и cpVenus-Gγ 2 ) были сконфигурированы на одной плазмиде, обеспечивая надежную коэкспрессию с предпочтительной стехиометрией. Мы показываем, что эти датчики хорошо подходят для микроскопии живых клеток и извлечения кинетических параметров с помощью одноклеточной логометрической визуализации FRET.Стандартизированная компоновка этих биосенсоров FRET для активации G-белка повысит надежность и воспроизводимость экспериментов внутри и между лабораториями. В данной статье это иллюстрируется надежной работой датчика Gα i1 в трех разных лабораториях без оптимизации условий эксперимента.

Одним из ограничений биосенсоров на основе переноса энергии для гетеротримерных G-белков является то, что они зависят от сверхэкспрессии гетеротримера, что может повлиять на естественное предпочтение GPCR для определенного класса гетеротримерных G-белков.Мечение эндогенных субъединиц флуоресцентными белками потенциально может облегчить это.

Исключительная чувствительность этих датчиков позволяет надежно обнаруживать активацию Gα и в первичных клетках с помощью эндогенных GPCR. Более того, эти биосенсоры можно использовать для прямого сравнения предпочтительных паттернов активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 между различными Gα и , связанными GPCR, что может помочь в разработке терапевтических стратегий, нацеленных на Gα и . сигнальные пути [42].

Методы

Конструирование слияний флуоресцентных белков

Для вставки mTurquoise2-Δ9 (здесь сокращенно mTq2) [25] в белки Gα i1 , Gα i2 и Gα i2 и Gα i3 9000 с версией a61 i3 9000 сайты рестрикции на его N-конце и С-конце конструировали путем амплификации mTurquoise2 с прямым праймером 5'-ATaccggttctATGGTGAGCAAGGGCG-3' и обратным праймером 5'-TAaccggtGATCCCGGCGGC-3' . Чтобы ввести Age1-сайт в Gα i1 -цитрин, мы провели полновекторную ПЦР на матрице RnGalpha i1 -цитрин [20] с прямым праймером 5'-ATaccggtGAACTCGCCGGCGTCATA-3' и обратным праймером 5 '-ATaccggtCGCGGTCATAAAGCCTTC-3' .Для введения Age1-сайта в Gα i2 -цитрин мы провели полновекторную ПЦР на матрице HsGalpha i2 -цитрин [20] с прямым праймером 5'-ATaccggtGAGGAGCAAGGCGTGCT-3' и обратным праймером 5. '- TAaccggtGGCGGTGCAGGACAGT-3' . кДНК, содержащая кодирующую последовательность для HsGalpha i3 с сайтом Age1, была синтезирована компанией Eurofins (www.eurofins.nl). Разрезание продукта ПЦР mTq2 и новых векторов Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 с помощью Age1 и последующее лигирование привело к получению RnGalpha i1 , помеченного mTq2 после положения 121, и HsGalpha i2,6 90, помеченного с помощью Age1. mTq2 после положения 114, аналогично ранее описанному функционально меченому Gα i1,2,3 [20].

Для конструирования варианта 1.0 сенсора Gα i1 была проведена ПЦР на плазмиде mTq2-Gα i1 с прямым праймером 5'-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3' и обратным праймером 3'-AGCTAGTCACGCTAGATcc для введения сайта BamHI на С-конце и сайта NcoI на N-конце. Затем проводили тройное лигирование с продуктом ПЦР (вырезанным BamHI и NcoI), вектором, содержащим pGβ 1 -T2A-cp173Venus-Gγ 2 [43] (вырезанным BamHI и SacII), и вектором, содержащим pPRIG. -IRES [44] (вырезано NcoI и SacII).Полученная плазмида, pGβ 1 -2A-YFP-Gγ 2 -IRES-MATT-Gα i1 -CFP, коэкспрессирует MATT-Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 (нарушение локализации в плазматической мембране), pGβ 1 и cp173Venus-Gγ 2 ().

Чтобы сконструировать вариант 2.0 сенсора Gα i1 , мы провели ПЦР с мутагенезом с вариантом 1.0 в качестве матрицы путем амплификации с прямыми 5'-GAAAAACACGATGATAATATGGGCTGCACACTGAGC-'3 и 5'-GCTCAGTGTGTGCAGCTT9TCATATT3.2'TGCAGCTTCCATATT3.2'TGCAGCTTCCATATT3.Полученная плазмида, pGβ 1 -2A-cp173Venus-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -mTurquoise2-Δ9, коэкспрессирует Gα i1 -mTq2 (правильно расположен на плазматической мембране), pGβ 1000 и cpVenus-Gγ 2 ().

Чтобы создать единый плазмидный сенсор для Gα i2 и Gα i3 , мы провели ПЦР с удлинением с перекрытием [45]. Gα I2 -MTQ2 Был амплифицирован с помощью передней грунтовки '5-ACGATGATATATATATGGGCCTGCACCGTGA-3' и обратный грунтовки '5 -Tattactagaagctcagaagagggcgcagt-3' , а gα i3 -mtq2 был амплифицирован с передним праймером '5-acgatgataatatgggccccacgtgatga -3' и обратный праймер '5-TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3' . Еще одну ПЦР проводили на ранее описанном [26] одноплазмидном сенсоре Gα q с прямым праймером ‘5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3’ и обратным праймером ‘5—GCAGCCCATattatcatcgtgtttttcaaag-3’ . Затем описанный выше продукт ПЦР Gα i2 -mTq2 или Gα i3 -mTq2 смешивали с продуктом ПЦР сенсора Gα q и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с прямым праймером '5-. GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3' и обратный праймер '5-TATtctagaAGCTCAGAAGGGCCGCAGT-3' , и прямой праймер '5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3' и обратный праймер '5-TATtctagaAGCTTAATAAAG3'TCCACATTC2,4, соответственно.Затем полученные продукты ПЦР лигировали в костяк сенсора Gα q с SacII и XbaI, в результате чего получали pGβ-2A-cp173Venus-Gγ 2 -IRES-Gα i2 -mTurquoise2-Δ9 и pGβ 1 - 2A-cp173Venus-Gγ2-IRES-Gα i3 -mTurquoise2-Δ9 соответственно. Последовательности плазмид доступны по запросу. Плазмиды будут распространяться через Addgene: http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/. RnGα i1 -mCitrine и HsGα i2 -mCitrine были любезным подарком Скотта Гибсона [20].Обратите внимание, что кодирующая последовательность RnGα i1 отличается только одной аминокислотой от последовательности Gα i1 человека (S98A). Рецептор LPA 2 был получен с сайта cDNA.org. Ранее были описаны BK 2 R [46], α 2 AR [21], M 3 R [47] и рецептор A1 [48]. β 2 AR-P2A-mCherry был любезным подарком от Анны Петрашевской (Университет Амстердама).

Культура клеток и подготовка образцов

Клетки HeLa (Американская коллекция культур тканей: Манассас, Вирджиния, США) культивировали в Университете Амстердама (Амстердам, Нидерланды) с использованием модифицированной среды Игла Дульбекко (DMEM), снабженной Glutamax, 10% FBS, пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл).Все среды для культивирования клеток были получены от Invitrogen (Bleiswijk, NL).

Клетки трансфицировали в чашке диаметром 35 мм, содержащей покровное стекло диаметром 24 мм № 1 (Menzel-Gläser, Брауншвейг, Германия), с использованием 1–2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen), 0,5–1 мкг плазмидной кДНК и 50 мкл OptiMeM (Life Technologies, Bleiswijk, NL). После инкубации в течение ночи при 37°C и 5% CO 2 покровные стекла помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen, Breda, NL) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (PH = 7.4), 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCL, 1,8 мМ CaCL 2 , 0,8 мМ MgCl 2 и 20 мМ глюкозы). Всю микроскопию живых клеток проводили при 37°C.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были приобретены у Lonza и культивированы в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) на чашках, покрытых FN, в среде EGM-2, дополненной одиночными клетками (Lonza, Вервье, Бельгия). HUVEC использовали при пассаже номер 4 или 5. В качестве метода трансфекции использовали систему трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и соответствующий набор для трансфекции Neon (Invitrogen). Генерировали одиночный импульс при 1300 В в течение 30 мс для микропорирования HUVEC с 2 мкг кДНК, затем клетки высевали на покровные стекла, покрытые FN.

Для быстрого кинетического измерения активации Gα i1 клетки HEK293 культивировали в Вюрцбургском университете (Вюрцбург, Германия) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глютамина (2 мМ ) (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия), пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) и хранили при 37°С в атмосфере с 7% СО2.Клетки собирали и высевали на покрытые D-полилизином покровные стекла диаметром 24 мм при слиянии ~40%. Через три часа клетки временно трансфицировали 1,0 мкг рецептора (α 2 AR или аденозина A1) и 3,0 мкг pGβ 1 -2A-YFP-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -mTq2 кДНК на 6 -луночный планшет с реагентом для трансфекции Effectene ® (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Среду для выращивания обновляли через 24 часа, а измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов. Клетки содержали в среде для микроскопии (140 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, pH 7,3) и постоянно суперфузировали этим буфером или буфером, дополненным соответствующим лигандом, с использованием компьютеризированного устройство быстрой суперфузии, управляемое электромагнитным клапаном (ValveLink 8.2, Automate Scientific).

Широкопольная микроскопия

Ратиометрические измерения FRET в клетках HeLa (результаты представлены в ) выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH, Германия) в Университете Амстердама (Амстердам, Нидерланды), сохранено при 37°С, с масляным иммерсионным объективом (План-Неофлюор 40×/1.30; Carl Zeiss GmbH) и ксеноновой дуговой лампе с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK). Изображения были записаны с помощью охлаждаемой камеры устройства с зарядовой связью (Coolsnap HQ, Roper Scientific, Тусон, Аризона, США). Типичное время экспозиции варьировалось от 75 мс до 150 мс, а биннинг камеры был установлен на 4x4. Флуорофоры возбуждали светом с длиной волны 420 нм (ширина щели 30 нм) и отражали на образец с помощью дихроичного зеркала 455DCLP, эмиссию CFP регистрировали с помощью фильтра BP470/30, а эмиссию YFP регистрировали с помощью фильтра BP535/30, вращая колесо фильтров. .В экспериментах по совместной экспрессии YFP возбуждали светом с длиной волны 500 нм (ширина щели 30 нм) и отражали на образец с помощью дихроика 515DCXR, а эмиссию регистрировали с помощью фильтра BP535/30. Полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал и, для изображения отношения FRET, на просачивание эмиссии CFP в канале YFP ​​(55% интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для экспериментов FRET в HUVEC (результаты представлены на ) в компании Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) использовали микроскоп Zeiss Observer Z1 с числовой апертурой 40x 1.3 масляно-иммерсионным объективом и источником возбуждающего света HXP 120 В. CFP возбуждали через куб фильтра FRET (Exciter ET 436/20x и дихроичное зеркало 455 DCLP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США)). Излучение направлялось на присоединенный адаптер для двух камер (Carl Zeiss GmbH, Германия), управляющий дихроичным зеркалом 510 DCSP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США). Волны излучения в диапазоне 455–510 нм направляются на эмиссионный фильтр ET 480/40 (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США), а затем фиксируются камерой Hamamatsu ORCA-R2.Излучение с длиной волны 510 нм и выше направляется на эмиссионный фильтр ET 540/40m (Ludl Electronic Products, Нью-Йорк, США) и затем захватывается второй камерой Hamamatsu ORCA-R2. Получение изображений было выполнено с использованием программного обеспечения микроскопа Zeiss-Zen 2011. Все полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал. Полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал и просачивание излучения CFP в канале YFP ​​(62% интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для быстрых кинетических измерений активации Gα i1 (результаты представлены на рис. 1) визуализацию выполняли на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия), оснащенном масляным иммерсионным объективом с увеличением 63x и двухэмиссионная фотометрическая система (Till Photonics), как описано ранее [21]. Трансфицированные клетки возбуждали светом полихрома IV (Till Photonics). Освещение было установлено на 40 мс из общего времени интеграции 100 мс. Сигналы CFP (480 ± 20 нм), YFP (535 ± 15 нм) и отношения FRET (YFP/CFP) регистрировали одновременно (светоделитель DCLP 505 нм) при возбуждении на 436 ± 10 нм (светоделитель DCLP 460 нм). Сигналы флуоресценции регистрировали фотодиодами и оцифровывали с помощью аналого-цифрового преобразователя (Digidata 1440A, Axon Instruments). Все данные были записаны на ПК под управлением Clampex 10.3 программного обеспечения (Axon Instruments). Полученные отдельные трассы были приспособлены к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания для извлечения экспоненциальной постоянной времени, тау [39]. Полупериод активации (t 1/2 ) определяется как τ*ln2. В динамических экспериментах клетки стимулировали UK14,304 (10 мкМ), йохимбином (60 мкМ), брадикинином (1 мкМ), LPA (1 мкМ), карбахолом (100 мкМ), атропином (10 мкМ), изопротеренолом (10 мкМ), пропранололом (10 мкМ), S1P (500 нМ), 20 мкМ или 100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина в указанные моменты времени. ImageJ (Национальный институт здравоохранения) использовался для анализа необработанных микроскопических изображений. Дальнейшая обработка данных проводилась в Excel (Microsoft Office), а графики и статистика проводились с использованием Graphpad версии 6.0 для Mac, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com.

Конфокальная микроскопия

Клетки HeLa, трансфицированные указанными конструкциями, визуализировали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1, оснащенного масляным иммерсионным объективом с увеличением 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер пинхола был установлен на 1 единицу Эйри (<0,8 мкм).

Образцы последовательно возбуждались лазерной линией 457 нм и 514 нм и отражались на образец дихроичным зеркалом 457/514. Эмиссия CFP фильтровалась через фильтр эмиссии BP482/35; Эмиссия YFP фильтровалась через эмиссионный фильтр BP540/30. Во избежание просачивания изображения были получены в режиме последовательного строчного сканирования. Все полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал.

Конфиги Captain Carrot для Lacroix Fret для CMS 2021 V1.2 в Car Mechanic Simulator 2021 Nexus

Об этом моде

Этот мод добавляет конфигурации двигателя и трансмиссии в Car Mechanic Simulator 2021 для Lacroix Fret

.
Требования
Разрешения и кредиты

Кредиты и разрешение на распространение

  • Другие активы пользователя Все активы в этом файле принадлежат автору или взяты из бесплатных ресурсов моддеров.
  • Разрешение на загрузку Вы не можете загружать этот файл на другие сайты ни при каких обстоятельствах.
  • Разрешение на изменение Вы должны получить от меня разрешение, прежде чем вам будет разрешено изменять мои файлы, чтобы улучшить их.
  • Разрешение на преобразование Вам не разрешено конвертировать этот файл для работы в других играх ни при каких обстоятельствах.
  • Разрешение на использование актива Вы должны получить от меня разрешение, прежде чем вам будет разрешено использовать какие-либо активы в этом файле.
  • Разрешение на использование актива в модах/файлах, которые продаются Вам не разрешено использовать активы из этого файла в каких-либо модах/файлах, которые продаются за деньги в Steam Workshop или на других платформах.
  • Разрешение на использование активов в модах/файлах, которые зарабатывают очки пожертвований Вы не можете зарабатывать очки пожертвований для своих модов, если они используют мои активы.

Примечания автора

Этот автор не предоставил никаких дополнительных примечаний относительно прав доступа к файлам.

Кредиты файла

Этот автор не указал никого другого в этом файле

Система баллов пожертвований

Этот мод настроен на получение очков пожертвований.

Журналы изменений

  • Версия 1.2

    • Исправление ошибки, исправлена ​​проблема с номерным знаком в Config4

  • Версия 1.1

    • Добавлено 2 новых конфига (конфиги 4 и 5)

  • Версия 1.

    0


Конфигурации для Lacroix Fret

Этот мод добавляет конфигурации двигателя и трансмиссии в Car Mechanic Simulator 2021 для Lacroix Fret

Config2 - 4x4, добавляет соответствующий двигатель 4x4 и трансмиссию к стандартному варианту автомобиля

Configx4 - Voy , Добавляет соответствующий двигатель 4x4 и трансмиссию в вариант автомобиля Voyage

Config4 — EV, добавляет электродвигатель и аккумуляторную батарею и удаляет выхлопную систему и топливный бак для стандартного варианта автомобиля

Config5 — Voyage EV, добавляет электродвигатель

Название — переименовывает Lacroix Fret в Peugeot Bipper

У вас ДОЛЖЕН быть DLC Electric Car для конфигураций 4 и 5

Найдено:
Уровень заказа 5 и выше (Конфигурации 2 и 3), уровень заказа 7 и выше (Конфигурации 4 и 5)
Аукцион
Салон
Сарай
Свалка

Пожалуйста, не забудьте нажать ОТСЛЕЖИВАТЬ, чтобы получить n уведомлен о любых обновлениях этого мода

История версий:

V1. 0 - Первоначальный выпуск
V1.1 - Добавлены config4 и config5
V1.2 - Исправление ошибок, исправлена ​​проблема с номерным знаком в Config4

Кредиты: Red Dot Games & Playway для Car Mechanic Simulator 2021

Если вам нравится этот мод, почему не покупай мне кофе или печенье

Что нового в 4х4 лад. Достойные конкуренты внедорожника

Для тяжелых условий эксплуатации отечественный автопроизводитель выпускает модель под названием Нива. Эта модель когда-то была довольно популярна, так как была практически единственным доступным предложением с повышенной проходимостью... Много лет спустя, с момента появления внедорожника, он практически не изменился, так как все модификации носили почти декоративный характер. Пример - Нива Бронто (новая модель 2017) года выпуска, фото, цена, характеристики которой были официально опубликованы. Эта модель является модификацией внедорожника, вышедшего под названием Lynx. Снаружи этот автомобиль не претерпел существенных изменений. Отметим, что самое доступное предложение будет стоить 670 000 рублей — достаточно высокая цена, по которой сегодня можно купить Дастер или другой бюджетник.Рассмотрим особенности данного предложения от производителя АвтоВАЗ более подробно.

Классический дизайн корпуса

Технические характеристики

Ничего принципиально нового от нового предложения ждать не стоит. Среди технических характеристик выделим следующие пункты:

  • На выбор только один двигатель, который имеет объем 1,7 литра и мощность всего 83 л.с. Из-за относительно легкого веса внедорожника этой мощности может хватить, но водитель не сможет чувствовать себя комфортно.К тому же не стоит забывать, что силовой агрегат практически не меняется годами.
  • Из-за квадратной формы кузова, что приводит к незначительной обтекаемости, и из-за высокого клиренса автомобиль плохо держит дорогу. По заявлению автопроизводителя, максимальная скорость составляет 136 км/ч.
  • Коробка механическая, автомат не устанавливается. Количество передач - 5.
  • Расход топлива при сравнительно небольшой мощности значительный - в смешанном цикле потребуется 12 литров на 100 км пройденного пути.
  • Размеры кузова следующие: длина 3680, ширина 3740, высота 1713 мм, база 2200 мм, дорожный просвет довольно внушительный - 240 мм. Установленный бак рассчитан на 42 литра. Как ранее отмечалось, вес автомобиля сравнительно небольшой – 1285 килограммов.

Важным моментом является то, что внедорожник теперь выпускается исключительно в трехдверном исполнении. Появление пятидверки пока не планируется.

Внешний вид

За последние несколько дней внешний вид Нивы практически не изменился. В других комплектациях автомобиль становится более агрессивным за счет использования пластиковых накладок:

  • По периметру кузова есть пластиковая накладка, на арках расширяется.
  • В передней части кузова также есть пластиковая накладка, которая одновременно служит решеткой радиатора.
  • Головная оптика немного утоплена, за счет передней части она стала немного агрессивнее.
  • Задняя часть практически не изменилась.

Если сравнивать предыдущую версию и рассматриваемую, то изменений практически нет.Учитывая существенную разницу в стоимости, этот момент можно назвать существенным недостатком нового предложения АвтоВАЗа.

Интерьер Нива 4х4 Бронто 2017

Если экстерьер привычный и может кому-то понравиться, то интерьер - явный пережиток прошлого. Несмотря на то, что по цене Нивы можно купить новый бюджетник с измененным салоном от других производителей, АвтоВАЗ практически не вкладывает средства в развитие салона. Используемый пластик и только текстиль при отделке имеют достаточно низкое качество. Среди особенностей отметим также следующие пункты:

  • Центральная консоль представлена ​​комбинацией из нескольких кнопок, переключателей и рычажков. При этом блоки практически не различаются.
  • Тоннель между сиденьями представлен комбинацией из нескольких рычагов, отвечающих за блокировку дифференциала, переключение передач. Они не выглядят привлекательно.
  • Рулевое колесо без блоков управления, 4 спицы, изготовлено из пластика и не имеет накладки.
  • Приборная панель по-прежнему имеет прямоугольную форму.
  • Сиденья лишены боковой поддержки и других элементов, способных повысить комфортность нахождения в движении.
  • В салоне минимальное количество панелей, нет ни ящиков, ни кармашков для хранения вещей.

Глядя на салон, сразу можно сказать, что автомобиль относится к низшему классу, который приобретается для передвижения на небольшие расстояния. Трудно представить, как можно провести в таком салоне 10 и более часов при дальней дороге.

Нива Бронто отзывы владельцев 2017 года говорят о низком комфорте. Отсутствие всех современных удобств связано с тем, что таким образом удешевили машину, оставив при этом основные опции, связанные с обеспечением требуемой проходимости.

Комплектации и цены Нива 4х4 Бронто 2017 в новом кузове

Нива Бронто 2017 будет доступна в 4-х комплектациях, стоимость которых отличается всего на несколько десятков тысяч. Стоит учитывать, что на все варианты устанавливается только один мотор, как и трансмиссия.Поэтому о настоящем не может быть и речи. Также на выбор предлагается только одна комплектация, которая имеет несколько насадок. Стандартная версия имеет следующие особенности:


Автопроизводитель также выпускает внедорожник с дополнительным названием Image. При этом цена может быть 691 000 и 730 000 рублей. Даже при выборе функции сравнения этих двух автомобилей на официальном сайте отличия указаны только в окраске в Камуфляжный цвет. Проводя сравнительный анализ можно сказать, что версия Image имеет более высокую стоимость за счет установки более широких арок, накладок на пороги, противотуманных фар.

У этого автомобиля относительно немного конкурентов по проходимости, в основном все производятся на одном заводе. Что касается привлекательности экстерьера и комфорта, то за минимальную стоимость можно приобрести некоторые бюджетники, относящиеся к классу внедорожников. Нива 4х4 Бронто считается вместе с:

  1. Хантер.

В целом можно сказать, что эту модель сложно сравнить с каким-либо другим автомобилем из-за невысокой стоимости и высокой проходимости, практически полного отсутствия комфорта.Короткая база, минимальное оснащение салона и другие моменты определяют, что автомобиль обладает высокой проходимостью, которая обеспечивается определенными механизмами, но при этом стоимость предложения достаточно низкая.

Новую жизнь довольно обычному внедорожнику Нива отечественный автопроизводитель решил подарить ему, выпустив версию под названием Urban. Нива Урбан (новая модель 2017 года) фото, цена, характеристики и прочие моменты стали известны давно, выпускается по цене от 532 000 рублей и всего в двух комплектациях, которые существенно не отличаются друг от друга.Стоит учитывать, что внедорожник выпускается с 1997 года, и по сравнению с первыми поколениями изменения не существенны. Однако у этого автомобиля очень много поклонников, и в основном это связано с невысокой стоимостью и возможностью апгрейда под свои нужды. Стоит ли ждать существенных изменений от новинки? Давайте поближе познакомимся с внедорожником.

Новый покоритель бездорожья

Технические характеристики

На протяжении многих лет в случае, когда нужно купить автомобиль с высокой проходимостью и за минимальную сумму, выбирали Ниву.Она прекрасно подходит для загородной местности и решения большинства повседневных задач. Практичность, высокая проходимость, высокая ремонтопригодность – причин, по которым был выбран именно этот автомобиль, масса. Среди основных технических характеристик отметим следующие пункты:

  • Несмотря на то, что автомобиль позиционируется как внедорожник с высокой проходимостью, дорожный просвет был снижен на 10 миллиметров до 190 миллиметров.
  • Двигатель устанавливается исключительно бензиновый, мощность которого составляет 83 л.с.Объем двигателя, достаточно устаревшего по конструкции, составляет 1,7 литра. При достаточно небольшом объеме расход составил 10 литров.
  • Коробка передач представлена ​​механикой, которая имеет 5 скоростей переключения передач. Конструкция очень проста, устанавливалась на внедорожники последних поколений и не отличается высокой надежностью. Конечно, при необходимости можно провести ремонт своими силами.

В остальном это тот же внедорожник с полным приводом. Достаточно для разгона небольшого внедорожника требуется около 17 секунд.Вся вышеперечисленная информация определяет, что Нива не подходит для трассы, а подходит исключительно для бездорожья.

Экстерьер Нива Урбан 2017

Несмотря на стремление отечественного автопроизводителя развивать современный дизайн, Нива практически не изменилась. Нива Урбан отзывы владельцев 2017 года редко затрагивают экстерьер, так как кузов получился очень простым. При рассмотрении данного автомобиля выделим следующие моменты:

  • На новое поколение устанавливается немного другой бампер, который выполнен под цвет кузова и имеет пластиковые бамперы. Сложно сказать, как повлияет использование пластика на создание бампера, ведь Нива эксплуатируется в очень жестких условиях.
  • Обе комплектации оснащены современными легкосплавными дисками размером R16.
  • Немного переработана решетка радиатора, поверхность покрыта черной краской.
  • Передняя часть автомобиля также представлена ​​почти вертикальной плоскостью, что определяет высокое сопротивление при движении на высокой скорости. Поэтому на шоссе внедорожник не устойчив.
  • Зеркала заднего вида также имеют другую форму, которые также окрашены в черный цвет.
  • Форма также была немного изменена. задний дворник . Он позволяет обеспечить хорошую видимость при активных осадках.
  • Головная оптика не изменила своей формы, дизайн тоже очень простой. Несмотря на то, что многие автопроизводители переходят на диодные источники света и используют их даже при создании бюджетных автомобилей, отечественные по-прежнему активно используют обычные лампы.
  • Колесные арки немного увеличены, что позволяет устанавливать 16-дюймовые диски даже в базе.
  • Короткие свесы, как спереди, так и сзади, обеспечивают высокую проходимость внедорожника и возможность преодолевать глубокие ямы.

В целом внедорожник выглядит просто, последний рестайлинг можно отличить от предыдущей версии.

Интерьер

Салон автомобиля также претерпел небольшие изменения.Инженеры и дизайнеры позаботились о том, чтобы цена Нивы Урбан (новая модель 2017) в Тольятти существенно отличалась от той, которая сложилась на предыдущую версию. Интерьер можно охарактеризовать следующим образом:

  • Устанавливается новый руль.
  • Приборная панель такая же, как и во многих других автомобилях, выпускаемых под маркой Lada. Инженеры постарались сделать дисплей более читаемым в случае недостаточного количества наборов.
  • Также немного изменилась обивка кресел.Он представлен текстилем с уникальным дизайном. Также частично была организована боковая поддержка, что позволяет значительно повысить комфорт водителя и пассажиров.
  • Задний ряд не такой удобный, особенно в трехдверной версии. Задний ряд для сидения представлен трехместным диваном, который при необходимости можно сложить для увеличения багажного отделения. Учтите, что ровной поверхности пола получить не получится, но при необходимости диван можно демонтировать.
  • Между сиденьями сделан тоннель, на котором расположены рычаги управления коробкой передач, а также ручной тормоз... Мы также нашли место для подстаканников; при изготовлении панели использовался пластик.
  • Магнитолу можно назвать пережитком прошлого тысячелетия. Конструкция очень проста и не предусматривает никакой индикации.
  • Установленный ранее блок освещения не отличался высокой эффективностью; его тоже поменяли.

В остальном конструкция достаточно простая, представлена ​​недорогим пластиком. Панели угловатые, а качество сборки относительно низкое.

Комплектации и цены Нива Урбан 2017 в новом кузове

Купить внедорожник можно всего в двух комплектациях, а также в двух вариантах кузова. Укороченная версия с двумя дверями и задней крышкой багажника будет иметь большую проходимость. Нива поставляется под двумя наименованиями:

1. Люкс

Данное предложение будет стоить 532 000 руб. Полный привод, только один мотор. Стоит учитывать, что мощность всего 8 десятков л.с. недостаточно для комфортного передвижения по пересеченной местности.Автопроизводитель предоставил на выбор 7 цветов.

Однозначно радует, что на базе установлены ABS и BAS. Также в списке опций встречается обозначение EBD. В багажном отделении разместили розетку на 12 В, которую можно использовать для подключения различного оборудования, например, электронасоса. Водитель может рассчитывать на значительное упрощение управления за счет установки гидроусилителя. В рамках установленных законов проводилась тонировка стекол.

В люксовой версии также есть кондиционер, который не справляется с поставленными отзывами задачами. Наружные зеркала с подогревом и электроприводом. Как уже отмечалось ранее, внедорожник приобретается для решения множества повседневных задач, что определяет наличие фаркопа. Предусмотрена полноразмерная запаска со стальным диском. Аудиоподготовка была, но представлена ​​всего двумя динамиками.

2. Люкс Снежная королева

Почему в списке только три автомобиля? Причина довольно проста – стоимость «Нивы» невысока, она относится к бюджетному классу... Все конкуренты являются предложениями от зарубежных автопроизводителей, что приводит к более яркому дизайну и лучшей сборке.

В заключение отметим, что не стоит полагаться на Ниву как на автомобиль, предназначенный для повседневного использования. Это связано с небольшим комфортом, который обеспечен в салоне как для водителя, так и для пассажиров.

Руководство компании решило провести рестайлинг. Новая Лада Нива 4х4 2019-2020 года получила переработанный внешний вид, модернизированный салон. Некоторые решения были позаимствованы у соплатформы на базе Renault Duster 2-го поколения.

О том, чем интересен внедорожник в новом кузове, когда состоится старт продаж, о комплектациях и ценах на рестайлинговый автомобиль читайте в статье.

Какой будет новая Нива в 2019 году




Распродажа

Формы 4x4

Российский внедорожник сохранил классический внешний вид и обзавелся парой интересных элементов. Они остались узнаваемыми в Lada Niva.

  1. Круглая головная оптика, оснащенная галогенными лампами.Над ним установлены прямоугольные поворотники со встроенными дневными ходовыми огнями.
  2. Аккуратная решетка обшита горизонтальными перемычками, окрашенными в черный цвет. В центре большая эмблема компании ВАЗ.
  3. Аскетичный металлический бампер Лада Нива, имеющий дополнительную накладку, защитит автомобиль от царапин на дороге.
  4. Боковая часть выделяется черными зеркалами нового дизайна с увеличенной площадью поверхности. Это улучшает обзор с места водителя.
  5. Металлические дверные ручки, не окрашенные в цвет кузова и предназначенные для неудобного захвата.
  6. Для базовой комплектации Лада Нива 2019 2020 доступны обычные стальные штампованные диски, а более продвинутые комплектации уже получили литые 16-дюймовые диски.
  7. Тонкие передние стойки уменьшают слепые зоны, но это отрицательно сказывается на жесткости кузова при авариях.
  8. Задние стойки Lada Niva получили три фирменных вертикальных прорези, которые стали «визитной карточкой» модели.
  9. В корме установлены модернизированные стоп-сигналы прямоугольной формы, разделенные на несколько секций.
  10. Крышка багажника Лада Нива для удобства обзавелась дополнительной ручкой. Конструкция петель была переработана, что позволяет им работать дольше.


Общий дизайн Лада Нива 4х4 2019 остался узнаваемым с любого ракурса, а также сочетающим в себе брутальность, аскетичность и гармоничный стиль.

Цвет кузова

Производитель предлагает широкий выбор вариантов окраски Лада Нива, насчитывающий 11 оттенков.Автомобиль можно купить в следующих цветах кузова:

  • Белый;
  • зеленый;
  • черный;
  • Фиолетовый;
  • Красный;
  • синий;
  • Коричневый;
  • темно-серый;
  • серебристый металлик;
  • золотой;
  • зеленый камуфляж.


Будет ли оцинкован кузов

Все модели Lada Niva оцинкованы. Это позволяет дольше избегать коррозии кузова и прекрасно себя чувствовать в агрессивных условиях.Окружающая среда. Производитель заявляет, что с момента покупки до появления очагов ржавчины на кузове пройдет не менее десяти лет.

3 двери

Стандартная Лада Нива 4х4 2020 будет трехдверной. Его габариты составляют 3740/1680/1640, а багажное отделение вмещает 265 литров. При сложенных задних сиденьях полезный объем Lada Niva увеличится до 585 литров. Короткая колесная база вкупе с дорожным просветом в 200 мм позволяет отлично чувствовать себя на бездорожье.Начальная стоимость модели составляет 474 тысячи рублей.

Фотографии интерьера



Мягкие линии кресла
салон руля
модернизированная форма

При разработке интерьера Нивы основной упор был сделан на улучшение качества материалов и доводку эргономики автомобиля. Визуально салон остался прежним.

  1. Большое четырехспицевое рулевое колесо отделано кожзаменителем.
  2. Приборная панель Лада Нива - два больших аналоговых циферблата тахометра и спидометра с небольшими информационными шкалами по бокам.
  3. В качестве материалов салона используется твердый пластик, устойчивая к царапинам, не оставляющая следов ткань.
  4. Обновленные кресла Лада Нива имеют измененный профиль, что позволяет занять удобную позу и не уставать в дальней дороге. А вот слишком мягкая подушка, а также слабая боковая поддержка негативно сказываются на комфорте.
  5. Задний ряд представляет собой один сплошной диван на трех пассажиров. Однако высоким попутчикам места будет мало — их колени упираются в кресла в первом ряду.
  6. Центральная консоль Нивы оснащена архаичной печкой с органами управления в виде двух ползунков, а внизу расположены большие прямоугольные кнопки второстепенных функций.
  7. Селектор коробки передач расположен на тоннеле, как и рычаг управления режимами движения.

Технические характеристики

Для Lada Niva 4x4 требуется только один Газовый двигатель, объемом 1,7 литра. Рядная четверка развивает 83 лошадиные силы при 129 Нм крутящего момента.Максимальная скорость автомобиля «Нива» составит 142 км/ч, а первую сотню внедорожник развернется за 17 секунд.

Все четыре колеса приводятся в движение стандартной 5-ступенчатой ​​механической коробкой передач с жесткой блокировкой межосевых дифференциалов. Аппетит Нивы 10 литров бензина на 100 километров в смешанном цикле. Передняя подвеска независимая, с гидравлическими амортизаторами, а задняя подвеска рычажная, зависимая.

Есть информация, что в скором времени ожидается появление более старого 1,8-литрового двигателя с увеличенной до 99 лошадиных сил мощностью, улучшенной динамикой и тягой.Для остановки внедорожника Lada Niva предназначены дисковые вентилируемые тормоза спереди и барабанные механизмы сзади.

Когда выйдет в России



Уже известна дата выхода новой Lada Niva. Выпуск обновленного внедорожника запланирован на этот год. Этот автомобиль достанется всем официальным представителям концерна ВАЗ в начале 2020 года.

Новый кузов, комплектация и цены

Внедорожник будет представлен в нескольких версиях. Цена базовой версии Нивы Классик начинается от 474 тысяч рублей.Такой автомобиль получит систему ABS, распределение тормозных усилий EBD, крепления для детских кресел ISOFIX. Внутри будет 12-вольтовая розетка, передние электростеклоподъемники и тонированные стекла.

Комплект Lux

Следующий вариант - модификация Luxe. Такая Lada Niva уже оценивается в 494 тысячи рублей. Среди опций будет еще одна розетка в багажном отделении, подогрев передних сидений, а также электропривод наружных зеркал. Нива комплектуется литыми дисками Niagara с шинами Pirelli.Опционально доступен кондиционер (+30 тыс.).

Топовым исполнением станет исполнение Lada Niva Black Edition 2019, которое оценивается в 530 тысяч рублей. Автомобиль получил полностью черный экстерьер с алюминиевыми дисками, боковыми зеркалами с электроприводом и подогревом, подогревом сидений, тонировкой. Кузов окрашен в темный металлик, имеется оригинальная комбинированная обивка салона, шторка в багажнике, кондиционер.

5-дверная версия 4x4

Есть длиннобазная Lada Niva 4x4, оснащенная пятью дверями.Габариты такого автомобиля увеличились – 4240/1440/1640 при базе 2,7 метра, что позволяет разместить больше пассажиров и багажа. Список оборудования для модели остался прежним, а вот цена выросла – она колеблется в пределах 543 – 600 тысяч рублей.

Нива Вижн полный комплект

Разрабатывается Lada Niva следующего поколения. Концепт под названием Vision уже был показан. Этот прототип получил серьезно переработанный внешний вид, обновленный салон, некоторые технологии позаимствованы у Renault Duster второго поколения.Однако его внедрение в модельный ряд АвтоВАЗа пока не рассматривается.

Новый клиренс нива
офигенные линии кресла
формы новая нива

Сколько стоит новая Нива 4х4

Комплектация Стоимость 3-дверки, тыс. руб. Цена 5-дверки
Классический 473 543
Люкс 493 562
Люкс + кондиционер 522 591
530 599

Когда новая модель поступит в продажу?

Автомобиль скоро появится в салонах официального дилера АвтоВАЗа.Для получения дополнительной информации посетите веб-сайт компании. Здесь вы можете оформить предварительный заказ или записаться на тест-драйв модели.

Фото, цена, начало продаж

Прайс
Модернизированный бестселлер
Классные концептуальные диски

Внедорожник

Лада Нива поступит во все города России, где есть официальный представитель компании АвтоВАЗ. Покупать автомобиль лучше у официального дилера – это позволит купить автомобиль по хорошей цене и закрепить сделку.

После внешнего рестайлинга, проведенного в 2009 году, автомобили семейства Шевроле Нива выпускались без изменений еще несколько лет. В 2014 году был представлен концепт, который должен стать прототипом автомобилей нового поколения. И это относится к 2017 году — как раз на этот год запланирован серийный выпуск. Новая Нива Шевроле 2017 года стала объемнее и мощнее – этим она отличается от «старой» Нивы. Улучшилась отделка салона и шумоизоляция, что не могло не сказаться на цене.

Шевроле Нива 2017 Технические характеристики

Рассмотрим подробнее характеристики и возможные комплектации.

Сердце автомобиля — двигатель

Рассматриваемый внедорожник может быть оснащен одним из двух двигателей внутреннего сгорания: ВАЗ-21179, переработанным и устанавливаемым на Chevrolet Niva, или двигателем EC8 концерна PSA.

Параметры:

  • 21179 — 1,8 л, 122 л. с. и 170 Н*м;
  • EC8 - 1.8 л, 136 л.с., 170 Н*м.

С мотором EC8, а также с «механикой» разгон до «сотни» занимает 10,3 секунды ... может быть 8,8 или 14,1 литра на 100 км. Цифры даны для режимов «трасса» и «город».

Полный комплект с двигателем 21179

С двигателем 21179 все выглядит несколько хуже, но именно он станет основой комплектаций, предлагаемых в 2017 году.

Важный атрибут Нивы Шевроле 2017 года – постоянный полный привод.При таком типе трансмиссии об экономичности говорить не приходится. А "моноприв" появится где-то в 2018 году...

Изменения шасси

Во втором поколении было решено оставить двухступенчатую раздаточную коробку, а также блокировку заднего дифференциала. «Раздатка» будет располагаться в одном здании с МКП.

Поэтому комплектации с АКПП не предусмотрены. Передняя подвеска будет независимой и оснащена стабилизатором поперечной устойчивости. Все как у предыдущей Шевроле Нивы.

Нива Шевроле 2017

Задняя подвеска останется зависимой, включая "рулевое устройство". Было решено установить 16-дюймовые диски, но это для топовых комплектаций. В "базе" наверняка будет что-то попроще.

Нива Шевроле 2017

Кузов увеличен с 3850 до 4150 мм. Его «усилили», но проходимость лучше не станет — колесная база по сравнению с поколением «1» заметно удлинилась.Свесы остаются короткими.

Нива Шевроле 2017

Электроника и опции

Нива Шевроле 2017 года будет выпускаться с новыми, разработанными «с нуля» сиденьями. «Приборка» выполнена аналоговой, а диагональ дисплея составляет 5 дюймов.

Интерьер

В отделке использованы только качественные материалы. Звукоизоляция тоже удовлетворительная.

Комплект опций и оборудования

  • Системы ABS + BAS, а также ESC;
  • Ремни с преднатяжителями;
  • Кондиционер;
  • Иммобилайзер;
  • Встроенный навигатор с возможностью обновления файлов;
  • Мультируль, электрические стеклоподъемники, сигнализация с брелоками.

Цены и начало продаж

Сначала предполагалось, что ценовой диапазон будет следующим: от 459 до 600 тыс. руб. Так было еще в 2015 году. Но в 2016 году не смогли наладить производство, и сейчас непонятно, насколько может вырасти цена.

Вся информация о новой Шевроле Нива 2017 на видео

В начале весны 2017 года филиал концерна АвтоВАЗ начал серийное производство обновленной модификации внедорожника Нива Бронто (новинка 2017 года, фото, цена, характеристики в обзоре).Поклонники получили возможность купить автомобиль в июле того же года.

Надежный внедорожник из России

Автомобиль сохранил свои уникальные внедорожные параметры и получил пластиковые обвесы. Отличная проходимость стала неоспоримой чертой автомобиля. Производитель обещает, что комфорт станет еще лучше, поэтому рестайлинговая Lada 4x4 обязательно понравится автовладельцам.

Экстерьер

Громоздкий и массивный вездеход выглядит строго, классически и брутально благодаря перечисленным изменениям:

  • Литые колесные диски размером 235/75 R15 с глубоким протектором для езды по бездорожью.
  • Антигравийное покрытие колесных арок для долговечности.
  • Резиновые уплотнители колесных арок.
  • Эффектные рейлинги на крыше.
  • Пластиковые детали выполнены без покраски, но смотрятся особенно оригинально.
  • Благодаря улучшенному качеству окраски кузов надежно защищен от царапин и повреждений.
  • Дифференциалы с самоблокирующимся мостом спереди и сзади.
  • Усиленная задняя ось.
  • Отличный дорожный просвет от 205 до 240 мм.
  • Улучшенные качественные пружины подвески и амортизаторы с увеличенным ходом.
  • Декоративные наклейки по бокам.
  • Пластиковые бамперы, усиленные стальными прокладками.
  • Красивая решетка радиатора.
  • Возможность выбора цвета корпуса.

Помимо перечисленных параметров, Нива Бронто 2017 обеспечена функционалом Имидж, в него войдут обновленные бампера из прочного пластика, расширенные колесные арки, противотуманки, стильные накладки на пороги.

Габаритные параметры автомобиля:

  • Длина 368,0-374,0 см.
  • Ширина 171,3 см.
  • Рост 169,0-190,0 см.
  • Межосевое расстояние 220,0 см.
  • Дорожный просвет 240 мм.
  • Снаряженная масса автомобиля 1285 кг, а полная масса 1610 кг.

Благодаря отличным характеристикам автомобиль без проблем справится с задачей передвижения по городским дорогам или езды по бездорожью.

Интерьер салона

Внутреннее убранство Нивы Бронто не отличается от стандартного внедорожника... Все детали в декоре созданы из недорогих, но качественных и надежных материалов. Качество сборки выполнено на высшем уровне. Рестайлинг салона отличается следующим:

  • Проработанная шумоизоляция.
  • Слегка тонированный для дополнительного комфорта.
  • Подогрев передних сидений.
  • Усилитель руля.
  • Окна в дверях.
  • Электропривод и обогрев наружных зеркал.
  • Кондиционер.
  • Функциональный мультимедиа.
  • Крепления детского сиденья ISOFIX.
  • На заднем сиденье достаточно места для трех пассажиров.
  • Центральная консоль с приборной панелью улучшила эргономику управления.
  • Анатомические кресла удобнее и удобнее.

Объем багажного отделения 265 литров, а при сложенных спинках задних сидений будет 585 литров, что вполне достаточно.

Технические характеристики

Внедорожник оснащен 8-клапанным бензиновым агрегатом мощностью 83 силы.5-ступенчатая работает как коробка передач. Механика. Максимальный крутящий момент составляет 129 Н/м при 4000 об/мин.

Возможная скорость 137 км/ч, разгоняется до 100 км примерно за 18 секунд. Расход бензина 12 литров в смешанном режиме. Возможна поставка оборудования:

  • мощная защита коробки передач и РК;
  • передняя и задняя лебедки съемные со сменной опорой дышла;
  • тяговое оборудование, противотуманки и габариты по бокам рейлингов или багажника.

Автомобиль с полным приводом и центральным распределением тяги в оптимальном сочетании. Он также отличается раздачей с пониженными передачами и передаточными числами с функцией самоблокировки.

Корпус конструкции несущий, двигатель продольный. Спереди независимая рессора, рычаги подвески, амортизаторы и стабилизаторы. Сзади красуется независимая подвеска с неразъемным мостом и приборами.

Комплектация и цены Нива Бронто 2017 в новом кузове

Нива Бронто, по отзывам владельцев 2017 года, можно смело назвать настоящим городским внедорожником.Автомобиль пользуется большим спросом у горожан, а также выступает в роли отличного внедорожника, который разрабатывался специально для жестких испытаний в стиле Off-road.

Автомобиль комплектуется 4 видами комплектаций, которые отличаются дополнительными опциями:

  • Стандарт 21214-50-070 стоимостью 676 тыс. руб.
  • Standart Image 21214-52-070 стоимостью 701 тыс. руб.
  • Стандарт 21214-51-070 стоимостью 710 тыс. руб.
  • Standart Image 21214-53-070 стоимостью 740 тыс. руб.

Нива 2017 представлена ​​в шести цветовых вариантах: белый, черный, красный, ярко-синий, серебристо-темно-серый, золотисто-коричневый.

В автосалонах официальных дилеров покупатели могут подобрать городскую модификацию Нивы 4х4 Бронто Урбан по цене от 526 тысяч рублей или стандартную 4х4 по цене от 475 тысяч рублей.

В базовый комплект входят:

  • мощные пружины с амортизаторами;
  • самоблокирующийся дифференциал;
  • улучшенный задний мост;
  • дополнительная защита колесных арок;
  • габариты дневного хода;
  • антиблокировочная тормозная система с функцией экстренного торможения;
  • распределение тормозного усилия;
    • Розетка
  • в багажнике;
  • гидроусилитель руля;
  • электростеклоподъемники передних дверей;
  • подогрев сидений;
  • аудиосистема;
  • Запасное стальное колесо диаметром 16 дюймов.

Решено установить в колесные арки расширители, надежно защищающие конструкцию от песка или пыли. Шины Cordiant SUV Off road . Поскольку автомобиль предназначен в основном для условий бездорожья, разработчики не забыли увеличить дорожный просвет до 240 мм.

Конкуренты

Достойными соперниками Нива Бронто 2017 года являются следующие автомобили:

Потенциальным конкурентом по праву называют Ниву Шевроле, ее отличает красивый и эффектный экстерьер, отличная эргономика водительского сиденья...Высокий клиренс и проходимость делают Ниву популярной. В целом он вынослив, надежен и доступен по цене.

Но большой расход бензина, пониженная коррозионная стойкость могут испортить общее впечатление об автомобиле. Шумоизоляцией не выделяется, подвеска жестковата, а коробка автомат иногда дает сбои.

Особенности

Важным отличием Нивы Бронто от обычной модели является высокая проходимость за счет внедрения следующих инновационных разработок:

  • Высокий уровень подвески.
  • Переработанный дорожный просвет.
  • Улучшенная резина.
  • Пара с пониженной передачей.

С целью увеличения подвески ход передних амортизаторов увеличен на 2,5 см, а задних тормозов - на 5 см. Под передними шаровыми опорами теперь стоят специальные проставки, а пружины поднялись на 4 см. Такой подход увеличил дорожный просвет автомобиля и снизил динамику нагрузок, поэтому он отлично справится с кочками и любыми неровностями на дорогах.

Изменена колесная база внедорожника. Арки оснастили специализированными эластичными расширителями, а для более высокой проходимости можно использовать колеса с шинами, которые имеют специальные козловые проушины и доступны в трех размерах.

Достоинства и недостатки

Чтобы лучше ознакомиться с техническими возможностями и свойствами автомобиля, вы можете ознакомиться с тест-драйвом. Среди достоинств Автовладельцы отмечают:

  • современный эффектный внешний вид;
  • просторный вместительный салон;
  • улучшенные отделочные материалы;
  • антикоррозийная обработка кузова и днища;
  • доступная стоимость;
  • широкая цветовая гамма;
  • отличная обзорность;
  • идеальный дорожный просвет;
  • шикарная проходимость.

Среди минусов:

  • один вид мотора;
  • АКПП нет;
  • нет части регулировок сиденья водителя;
  • жесткая подвеска;
  • посредственная маневренность.

Кроме того, многие автовладельцы отмечают стандартизацию и сертификацию автомобиля, что позволяет уверенно пройти техосмотр и подготовиться к нему.

Старт продаж в России

В настоящее время все подготовительные работы и технологические процессы запущены в работу.Нива Бронто 4х4 доступна автовладельцам у официальных дилеров нашей страны. Автомобиль можно купить по цене от 676 тысяч рублей, а за стильную камуфляжную окраску придется доплатить еще 34 тысячи рублей.

В конструкции автомобиля удалось воплотить в реальность изначальную идею разработки, то есть придать внедорожные характеристики, но при этом сохранить способность уверенно передвигаться по городским дорогам.

Отличные преимущества делают Ниву Бронто вне конкуренции среди любителей бездорожья, а также позволяют использовать ее как специализированный автомобиль для обычных городских дорог.

Фото



Машины и сцены погони из фильма «Не время умирать»

Новый фильм о Джеймсе Бонде «Не время умирать» выходит в кинотеатрах, и для автолюбителей это означает, что крутые машины становятся звездами не меньше, чем блестящие голливудские актеры. Как обычно, лидирует Aston Martin, но мы также видим действия, в которых участвуют Jaguar и Land Rover, а также Maserati и Toyota на второстепенных ролях.

Автомобили служат второстепенными персонажами и создают большую часть действия в этом боевике. Они также привлекают внимание к своим брендам.

«Они получают так много экранного времени, и они (автопроизводители) представляют свой бренд перед камерой, и точно так же мы получаем от них действительно умные, крутые автомобили», — сказал Нил Лейтон, супервайзер-координатор фильма. Управление двигателями .

В фильме представлены четыре разных автомобиля Aston Martin, среди которых, конечно же, DB5 Бонда 1960-х годов, один из самых красивых автомобилей, когда-либо созданных.DB5 играет главную роль в нескольких сценах погони и изрядно потрепался. Не волнуйтесь, однако, ни один настоящий DB5 не пострадал при создании этого фильма.

Лейтон сказал нам, что в фильме было использовано 10 DB5, две настоящие машины и восемь копий. Лейтон работал в британской гоночной мастерской Prodrive, поддерживая раллийную команду Subaru, а также в Aston Martin в отделе прототипов и отделе, поэтому он знал, как создавать автомобили, чтобы они работали.

Компания Лейтона, Auto Action Developments, работала с Aston Martin над созданием этих восьми копий.У команд было всего шесть месяцев на сборку автомобилей, но у них было преимущество знакомства.

«Это была естественная интеграция, когда я действительно мог вернуться, и мы говорили на одном языке», — сказал Лейтон. Лейтон также должен был добавить к автомобилям оборудование, необходимое для фильма, в процессе сборки. Это включало в себя как скоростное оборудование, делающее автомобили настоящими исполнителями, так и оборудование, помогающее в процессе съемок.

Астон Мартин DB5

Астон Мартин DB5

Астон Мартин DB5

Функции производительности Layton превратили реплики DB5 в готовые к работе рестомоды.Автомобили были построены на основе сделанного на заказ шасси с пространственной рамой и обтянуты кузовами из углеродного волокна. Лейтон сказал, что они использовали рядные 6-цилиндровые двигатели мощностью более 380 л.с., но не подтвердил марку. Конечно, для нас это звучит как 3,0-литровый рядный 6-цилиндровый двигатель BMW B58 мощностью 382 л.с. от Z4 и Toyota Supra.

Каждый каскадер также получил гоночный педальный узел, гидравлический ручной тормоз, быструю рулевую рейку, самоблокирующийся задний дифференциал, каркас безопасности, системы безопасности, гоночные ремни безопасности и гоночные сиденья.

«Нам было очень весело трясти эти машины и тестировать их, — отметил Лейтон.

Среди функций, которые команда Лейтона внедрила в автомобили, была так называемая система Gemini, которая включает в себя дистанционное управление с помощью электродвигателей и исполнительных механизмов. Лейтон сказал, что водители-каскадеры могут управлять машинами как по проводной связи, так и дистанционно на расстоянии до 500 метров. Компания Auto Action Developments разработала систему совместно с британской фирмой Shiftec с использованием контроллеров и модулей Shiftec.

Система управления скопирована с игровых консолей, с обратной связью по усилию руля и тормозов.Команда Лейтона могла запрограммировать передаточное число рулевого управления и тормозное давление в зависимости от потребностей в различных трюках, таких как повороты с ручным тормозом, J-повороты или маневры на низкой или высокой скорости.

Операторы могли управлять автомобилями удаленно, используя несколько методов. Они могли бы использовать камеру, установленную на устройстве слежения за головой на сиденье водителя, и удаленно видеть эти виды. Оператор мог посмотреть вправо или влево и увидеть то, что увидел бы водитель на сиденье DB5. Эти операторы могут использовать очки виртуальной реальности, прямую видимость от машины поддержки, следующей за ними, или ехать с места на сборщике вишни над звездным автомобилем.Эта система позволяет координатору трюков удаленно разбить машину, не подвергая никого опасности.

Два DB5 служили в качестве гондол, каждый с четырьмя выступами на крыше, которые соединялись с внешней клеткой, в которой водитель мог сидеть со всеми органами управления, чтобы управлять автомобилем с крыши. Эти элементы управления работают либо через сплошную колонку, проходящую через переднюю стойку, либо через насос для перекачки жидкости.

Aston Martin DB5 в

Aston Martin DB5 в

Aston Martin DB5 в

DB5 снимается в очень запоминающейся сцене, в которой пулеметы вылетают из фар, а Джеймс Бонд, которого играет Дэниел Крейг, косит плохих парней, делая пончики, вращаясь на одном месте. Водитель-каскадер Крейга, знаменитый раллийный гонщик Марк Хиггинс, выполнил трюк, а команда Лейтона настроила машину, чтобы это произошло почти по желанию. Единственная хитрость заключалась в использовании гидравлического ручного тормоза на левом переднем колесе, чтобы заставить машину вращаться.

Лейтон сказал, что Крейг тоже может исполнить этот трюк, но это не его работа.

«Честно говоря, он сделал свою долю (управления автомобилем). Мы репетируем и тестируем с Дэниелом перед съемками. Таким образом, Дэниел может выходить на улицу и дрейфовать, он может делать J-повороты и делать пончики, но, очевидно, он может сделать гораздо больше, чем просто крутое вождение», — сказал Лейтон.«Мы позволяем ему делать то, что у него получается лучше всего, а затем Марк и Ли (Моррисон, координатор трюков) приступили к работе с нашими автомобилями и устроили отличное шоу».

Все DB5 пережили съемку.

Aston Martin Valhalla

Aston Martin Vantage V8 в Сильверстоуне

Aston Martin DBS Superleggera в Сильверстоуне

В дополнение к DB5 Бонда, мы также видим Vantage V8 1974 года, управляемый Бондом и его возлюбленной Мадлен Свон, которую играет Леа Сейду, внешне очень похожий на Ford Mustang того периода; новое купе DBS Superleggera в качестве автомобиля для преемницы Бонда на посту агента 007, женщины по имени Номи; и концепция гиперкара Valhalla, висящая в аэродинамической трубе в штаб-квартире МИ-6.

Ранее в сцене погони, которая заканчивается пулеметным огнем, пара Jaguar XF преследует Бонда через древний город Матера в Италии. Команда Лейтона отрегулировала давление в шинах, настройки амортизаторов и высоту дорожного просвета, чтобы помочь автомобилям работать на мощеных улицах, терять или набирать сцепление с дорогой и справляться с поездкой по ступенькам. Они также добавили к этим автомобилям ручные тормоза, каркасы безопасности и гоночные педали, чтобы дать каскадерам больше контроля. Jaguar предоставил шесть XF для фильма.

Land Rover Defender 2020 года на съемках нового фильма о Джеймсе Бонде «Не время умирать»

Land Rover Defender 2020 года на съемках нового фильма о Джеймсе Бонде «Не время умирать»

Land Rover Defender 2020 года на съемках нового фильма о Джеймсе Бонде «Не время умирать» Фильм о Джеймсе Бонде «Не время умирать»

Партнер Jaguar, Land Rover, также получает много экранного времени, сначала на винтажном Land Rover Series III, которым управляет Бонд, а затем в погоне на внедорожнике, состоящей из двух частей. Сцена начинается с того, что два Range Rover SVR преследуют Бонда и Мадлен на Toyota Land Cruiser начала 2000-х вдоль береговой линии.Лейтон сказал, что в съемках использовались шесть SVR, и два из них погибли в авариях с переворотом, пытаясь поймать Бонда.

На видео, опубликованном компанией Land Rover, видно, как съемочная группа снимала часть погони на специально оборудованном грузовике Ford F-150 с большой стрелой на крыше. На видео также показано, как команда выполняла трюки: с пандусами для отправки SVR в полет, каскадерами в шлемах и полных гоночных костюмах и каркасами безопасности в транспортных средствах для защиты водителей.Моррисон сказал, что мощность и управляемость SVR сделали их идеальными машинами для погони, а Лейтон отметил, что все трюки были настоящими.

Затем погоня перемещается в поля и леса, где эскадрилья Land Rover Defender преследует Бонда. Лейтон сказал, что фильм снял с конвейера первых восемь «Защитников» для использования в съемках. В фильме Защитники бегут по реке, взбираются на крутые холмы и летают по воздуху, совершая несколько прыжков. Лейтон хвалил каскадера и гонщицу серии W Джессику Хокинс, которая выполняла многие трюки Defender и заменяла Седу.В лесу Бонд перехитрил водителей Защитников одного за другим, заставляя их по-разному разбиваться. В конце концов, он использует разбитый Защитник в качестве оружия против главного приспешника плохого парня.

Автомобили действительно играют важную роль.

«Не время умирать» выходит в кинотеатрах 8 октября. Посмотрите его вместе с любимым автолюбителем.

Как зарезервировать Ford Bronco 2021

LoadingЧто-то загружается.

После долгих лет ожидания наконец-то появился Ford Bronco 2021 года. Bronco больше не является единственной моделью, теперь это семейство полноприводных автомобилей с двух- и четырехдверной моделью, а также моделью Sport меньшего размера.

Форд также открыл свои книги заказов в понедельник вечером, поэтому все заинтересованные клиенты могут разместить заказ на новый Bronco за 100 долларов.Для этого просто посетите веб-сайт Ford и выберите местного дилера Ford. Залог, кстати, возвращается.

Затем, в конце 2020 года, этот дилер свяжется с вами для окончательной конфигурации и подтверждения цен. На своем веб-сайте Ford сообщает, что производство и первые поставки Bronco запланированы на весну следующего года.

Бронь на Форд Бронко 2021 года.Форд

Bronco нацелен прямо на Jeep Wrangler. Оба — прочные внедорожники, оба квадратные, оба полноприводные, у обоих съемные двери и панели крыши.

Business Insider сообщил в понедельник, что базовый двухдверный Bronco будет стоить от 29 995 долларов плюс 1495 долларов за пункт назначения и доставку.Ожидается, что четырехдверный Bronco будет дороже, его базовая цена составляет 34 695 долларов, сообщает Roadshow. Bronco Sport будет стоить от 28 155 долларов. Более конкретные цены на комплектации и опции пока недоступны.

На вопрос о количестве предварительных заказов Ford на новый Bronco представитель Ford сказал Business Insider: «Пока нет слов… скажем так, прошлой ночью мы были в панике с чрезвычайно высоким уровнем интереса».

В самом деле, многие в Твиттере показали, что сайт бронирования Бронко, по-видимому, рухнул из-за упомянутого интереса.

— Джимми Динсмор (@driversside) 14 июля 2020 г.
— Ford Motor Company (@Ford) 14 июля 2020 г. Это неудивительно, поскольку Ford планировал, что версия First Edition будет выпущена ограниченным тиражом. По данным Autoblog, он никогда не должен был длиться дольше 2021 модельного года, и производство будет ограничено 3500 экземплярами.

Бронь на Форд Бронко 2021 года.Форд

Если вы пропустили первое издание, не расстраивайтесь. Есть еще шесть версий Bronco на выбор.

Новый Jeep Grand Cherokee L 2021 года, обзоры, цены и характеристикиСистема остановки/запуска двигателя для экономии топлива была доработана, чтобы свести к минимуму количество запусков и остановок, связанных с незначительными движениями дроссельной заслонки, а активные опоры двигателя теперь используются для снижения шума, вибрации и жесткости.

Также примечательно: 3,6-литровый двигатель V6 в новом шасси установлен примерно на 1,5 дюйма ниже. Это снижает центр тяжести и улучшает способность этого джипа проходить повороты. Это также помогает Jeep пройти тесты на удар пешеходов в Европе, так как дает капоту больше места, чтобы прогнуться вниз при ударе.Однако из-за более низкого двигателя полуось на моделях 4WD теперь должна проходить через новый масляный поддон из литого алюминия.

Макс. тяговое усилие с пиками 3.6 — 6 200 фунтов и 7 200 фунтов для V8. Jeep Grand Cherokee L с топливным баком на 23 галлона и двигателем V6 имеет запас хода почти 600 миль.

Ищете больше мощности? Закажите 5,7-литровый Hemi V8, который не является обязательным для моделей Overland и Summit. Он выдает 357 лошадиных сил и 390 фунт-фут крутящего момента, что дает новому Grand Cherokee L максимальную буксирную способность 7200 фунтов.В этом двигателе реализована функция деактивации цилиндров, которая отключает четыре цилиндра на шоссе для экономии топлива.

Новая система отключения переднего моста способствует еще большему снижению расхода топлива. Если Grand Cherokee L определяет, что дорожные условия не требуют полного привода, передняя ось автоматически отключается, переводя автомобиль в режим RWD для экономии топлива. Полный привод автоматически включается при необходимости.

В новом Jeep Grand Cherokee L 2021 года доступны три типа систем полного привода.

Quadra-Trac I, входящая в стандартную комплектацию моделей Laredo и Limited, представляет собой постоянную односкоростную систему полного привода. Quadra-Trac II, входящая в стандартную комплектацию Overland, представляет собой активную систему полного привода с двухступенчатой ​​раздаточной коробкой и системой контроля движения на спуске. Quadra-Drive II, стандартный для Summit, также имеет высокий и низкий диапазоны, но включает электронный задний дифференциал повышенного трения. Если вы заказываете Off-Road Group для модели Overland, она поставляется с Quadra-Drive II.

Следует отметить, что 3,6-литровый Jeep Grand Cherokee L 2021 года имеет такую ​​же топливную экономичность EPA, как и стандартный 3.6-литровый Grand Cherokee, возвращающий 19 миль на галлон по городу / 26 миль на галлон по шоссе в форме 2WD и 18 миль на галлон по городу / 25 миль на галлон по шоссе с 4WD.

5,7-литровый Jeep Grand Cherokee L 2021 года, доступный только с 4WD, оценивается EPA в 14 миль на галлон по городу / 22 мили на галлон по шоссе.

3,6-литровый V6
290 лошадиных сил при 6400 об/мин
257 фунт-фут крутящего момента при 4000 об/мин

5,7-литровый V8
357 лошадиных сил при 5150 об/мин
390 фунт-фут крутящего момента при 4250 об/мин .

No related posts.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *