Лада 5 фото: AUTO.RIA – Фото Лада Пятерка картинки машины и фотогалерея

Фото 6

Полировка концов ладов.

Следующим шагом является использование сверхтонкой полировальной бумаги, которая доступна во многих стилях (включая ткани с микросетками и «ластики» для ладов с последовательной серией зерен) от поставщиков музыкальных инструментов и компаний-производителей гитарных аксессуаров, таких как Dunlop и Planet Waves. .

Возьмите полировальную бумагу или ткань и осторожно протрите концы ладов вдоль грифа. Это придает ладам красивый блестящий вид. Пока вы этим занимаетесь, почему бы не отполировать верхушки всех ладов?

Кондиционирование грифа.

Последним шагом в нашем процессе является подготовка грифа. Существуют десятки продуктов для очистки и кондиционирования необработанной древесины гитары. После небольшого исследования и проб и ошибок вы найдете продукт, который вам подойдет.

Нанесите кондиционер на гриф и потрите его старой зубной щеткой. Это удаляет скопившуюся грязь и пот и помогает древесине впитывать кондиционер. Когда гриф полностью покрыт, протрите его бумажным полотенцем.

Разлука с мыслями.

Как мы уже видели, основной причиной острых концов ладов является недостаток влажности. Оптимальный уровень влажности для любой гитары составляет 40-50 процентов.Кондиционирование грифа помогает свести к минимуму проблемы с влажностью, но по-прежнему необходимо поддерживать влажность вашей гитары. Итог: стоит проверить различные гитарные увлажнители. Разработанные для размещения в корпусе или футляре гитары, они недороги и просты в использовании. Увлажнители могут предотвратить острые концы ладов и сэкономить массу работы.

[ Обновлено 30.09.21 ]

Статьи с вашего сайта

Связанные статьи в Интернете

Разработка флуоресцентных датчиков на основе комбинации ПЭТ (фотоиндуцированный перенос электронов) и FRET (резонансный перенос энергии Фёрстера) для обнаружения воды

Эта статья находится в открытом доступе

Введение в технологию передачи энергии флуоресцентного резонанса (FRET) и ее применение в биологических науках

Автор : Paul Held, Ph.D, Отдел приложений, BioTek Instruments

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это физическое явление, впервые описанное более 50 лет назад, которое сегодня все больше и больше используется в биомедицинских исследованиях и разработке лекарств. FRET основан на передаче энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору в зависимости от расстояния. Из-за своей чувствительности к расстоянию FRET использовался для исследования молекулярных взаимодействий. FRET — это безызлучательная передача энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору.Молекула-донор — это краситель или хромофор, который первоначально поглощает энергию, а акцептор — это хромофор, которому впоследствии передается энергия. Это резонансное взаимодействие происходит на расстояниях, превышающих межатомные, без преобразования в тепловую энергию и без каких-либо столкновений молекул. Перенос энергии приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции донора и времени жизни в возбужденном состоянии, а также к увеличению интенсивности излучения акцептора. Пара молекул, которые взаимодействуют таким образом, что возникает FRET, часто называют парой донор/акцептор.

Хотя существует множество факторов, влияющих на FRET, первичных условий, которые необходимо выполнить для возникновения FRET, относительно немного. Молекулы донора и акцептора должны находиться в непосредственной близости друг от друга (обычно 10-100 Å). Спектр поглощения или возбуждения акцептора должен перекрываться со спектром флуоресценции донора (рис. 1). Степень, в которой они перекрываются, называется интегралом спектрального перекрытия (J). Ориентации диполей донорного и акцепторного переходов должны быть приблизительно параллельны.Предполагая, что пары донор-акцептор совместимы, наиболее важным элементом, необходимым для возникновения FRET, является близость пар. Фёрстер продемонстрировал, что эффективность процесса (Е) зависит от обратного шестого расстояния между донором и акцептором (см. уравнение 1). [1]

Где Ro — расстояние Фёрстера, на котором передается половина энергии, а r — фактическое расстояние между донором и акцептором.Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50%, называется радиусом Фёрстера (Ro). Величина Ro зависит от спектральных свойств донора и акцептора. Расстояния Ферстера в диапазоне от 20 до 90 Å наиболее удобны для изучения биологических макромолекул. Эти расстояния сравнимы с диаметрами многих белков, толщиной биологических мембран и расстояниями между сайтами на многосубъединичных белках. Любой процесс, влияющий на скорость передачи энергии, позволяет количественно оценить этот процесс.В результате FRET часто называют спектроскопической линейкой. Обратите внимание, что расстояние Ферстера (Ro) зависит от ряда факторов, включая квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора (fd), показатель преломления раствора (n), угловую ориентацию диполя каждой молекулы (k2) и интеграл спектрального перекрытия донора и акцептора (J). См. уравнение 2.

Рис. 1.Схематическое представление интеграла спектрального перекрытия

В качестве примера влияния расстояния на эффективность передачи энергии можно использовать произвольные числа для расстояния Фёрстера (Ro) и фактического расстояния (r). Если Ro произвольно установить равным 1 (Ro = 1), а расстояние между донором и акцептором также равно 1, то r = Ro, и уравнение для эффективности будет следующим: E = 1 ⁶ /(1 ⁶ + 1 ⁶ ), что равно 0. 5 (т.е. 50%). Это полумаксимальное значение и есть то, что определяется как расстояние Фёрстера. Если расстояние в 10 раз меньше (например, r = 0,1Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 0,1 ⁶ ) = 0,999999, что значительно эффективнее. Однако, если расстояние между донором и акцептором в 10 раз больше (т. е. r = 10Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 10 ⁶ ) = 0,0000001. Эта исключительная чувствительность к расстоянию позволяет использовать FRET для экспериментов с близостью.

Обычно донорная и акцепторная части различаются, и в этом случае FRET можно обнаружить по появлению флуоресценции акцептора или по тушению флуоресценции донора. Донорный зонд всегда представляет собой флуоресцентную молекулу. Обратите внимание, что люминесцентные молекулы ведут себя как флуоресцентные молекулы в отношении их излучения. При соответствующем возбуждении его электроны перескакивают из основного состояния (So) на более высокий колебательный уровень. Очень быстро (в течение пикосекунд) эти электроны распадаются до самых низких колебательных уровней (S1) и, в конечном счете, (в течение наносекунд) распадаются обратно в состояние So, при этом испускается фотон света.Когда условия для возникновения FRET соблюдены, затухание флуоресценции донора и передача энергии акцептору будут конкурировать за затухание энергии возбуждения. При резонансной передаче энергии фотон НЕ излучается, а энергия передается молекуле-акцептору, электроны которой, в свою очередь, возбуждаются, как описано для молекулы-донора. Последующий возврат в основное состояние испускает фотон (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение колебательных энергетических состояний электронов, возникающих во время FRET.

Измерение

Обнаружение и количественный анализ FRET, безусловно, можно осуществить различными способами. Поскольку FRET может привести как к уменьшению флуоресценции донорной молекулы, так и к увеличению флуоресценции акцептора, можно провести пропорциональное определение двух сигналов. Преимущество этого метода заключается в том, что можно измерить взаимодействие, не зависящее от абсолютной концентрации сенсора.Поскольку не все акцепторные фрагменты являются флуоресцентными, их можно использовать в качестве средства для гашения флуоресценции. В этих случаях те взаимодействия, которые приводят к тому, что флуоресцентная донорная молекула оказывается в непосредственной близости от такой молекулы, приводят к потере сигнала. И наоборот, реакции, устраняющие близость флуоресцентного донора и гасителя, приведут к увеличению флуоресценции. Одним из таких примеров может быть анализ протеазы. Эти анализы обычно включают флуоресцентную часть на одном конце и гасящую молекулу на другом конце, разделенные пептидом, содержащим последовательность расщепления протеазой.

Некоторые примеры

Генетически кодируемые флуоресцентные красители, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и родственные молекулы синего, голубого, желтого и красного цветов, обеспечили способность выполнять FRET in vitro, особенно в живых клетках [2]. Эти белки образуют пары FRET друг с другом, а также с обычными красителями. Они могут быть связаны с другими белками генетически или ковалентно, но при этом сохраняют свою флуоресцентную способность. Эти красители полезны тем, что являются генетическими элементами, которые могут быть связаны с другими генами для образования химерных белков.Эти химерные белки содержат GFP (или родственный элемент флуоресцентного белка) и предполагаемый связывающий домен. С различными химерными белками (один донор и один акцептор) можно исследовать белок-белковые взаимодействия. Только тогда, когда пары донор/акцептор взаимодействуют посредством белок-белковых взаимодействий, возникает FRET. (Рисунок 3)

Рисунок 3. Схематическое изображение взаимодействия двух разных химер флуоресцентных белков. Взаимодействия белок-белок между белками, помеченными A и B, приводят к тому, что синий флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок оказываются достаточно близко друг к другу, чтобы обеспечить возможность возникновения FRET. В этом примере возбуждение синего флуоресцентного белка приводит к испусканию флуоресценции зеленым флуоресцентным белком.

Органические цианиновые красители Cy3, Cy5, Cy5.5 и Cy7, излучающие в красной области спектра (>550 нм), имеют ряд преимуществ. Диапазон их излучения таков, что фоновая флуоресценция часто снижается. Кроме того, можно измерять большие расстояния (> 100 Å) благодаря высоким коэффициентам экстинкции и хорошим квантовым выходам. Даже донорно-акцепторные пары с разделенными спектрами излучения (т.е. низкий интеграл перекрытия) приводят к приемлемым расстояниям Фёрстера. Например, Cy3, который максимально излучает при 570 нм, и Cy5, который излучает при 670 нм, имеют расстояние Ферстера> 50 Å. Большое расстояние между парами позволяет измерять излучение акцептора в результате FRET без помех от излучения донора. Кроме того, эти молекулы могут быть связаны непосредственно с определенными участками в синтетически полученных нуклеиновых кислотах, что позволяет использовать FRET для оценки отжига нуклеиновых кислот.

Рис. 4.Схематическое изображение FRET, возникающего между флуоресцентными фрагментами Cy3 и Cy5 при отжиге меченых олигонуклеотидов.

В примере, изображенном на рисунке 4, два комплементарных олигонуклеотида РНК помечены Cy3 и Cy5 соответственно. Когда эти меченые молекулы не отжигают (рис. 4А), возбуждение олигонуклеотида РНК, меченного Cy3, светом при 540 нм приводит только к излучению света Cy3 при 590 нм, в то время как комплементарная олигонуклеотидная РНК, меченная Cy5, не излучает любой свет с длиной волны 590 нм или его истинная длина волны излучения 680 нм.Однако, когда двум олигонуклеотидам дают возможность отжигаться, непосредственная близость молекул позволяет осуществить перенос FRET. Это приводит к излучению света с длиной волны 680 нм, когда отожженная молекула возбуждается светом с длиной волны 540 нм. Обратите внимание, что не вся эмиссия Cy3 при 590 нм теряется, но значительная ее часть теряется.

Рисунок 5. Схематическая диаграмма активности FRET, используемой VSP

(VSP) — это технология анализа на основе переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET), используемая для открытия лекарств с высокой пропускной способностью ионных каналов.Донор FRET представляет собой связанный с мембраной кумарин-фосфолипид (CC2-DMPE), который связывается только с внешней стороной клеточной мембраны. Акцептор FRET представляет собой подвижный, отрицательно заряженный, гидрофобный оксонол [DiSBAC ₂ (3) или DiSBAC ₄ (3)], который будет связываться с любой стороной плазматической мембраны в ответ на изменения мембранного потенциала (рис. 5). Именно зависимость от расстояния используется в ВСП. Только тогда, когда акцептор DISBAC ₂ (3) расположен снаружи клеточной мембраны, возможен FRET.Покоящиеся клетки имеют относительно отрицательный потенциал, поэтому два зонда связываются с внешней стороной клеточной мембраны, что приводит к эффективному FRET. Возбуждение донорного зонда CC2-DMPE (при ~ 400 нм) генерирует сильный красный сигнал флуоресценции (при ~ 590 нм) от акцепторного зонда оксонола. Когда мембранный потенциал становится более положительным, как это происходит при деполяризации клеток, оксоноловый зонд быстро перемещается (в масштабе доли секунды) на другую сторону мембраны (рис. 5). Таким образом, каждый оксоноловый зонд «чувствует» изменения напряжения в клетке и реагирует на них.Эта транслокация разделяет пару FRET, поэтому возбуждение донорного зонда CC2-DMPE теперь генерирует сильный сигнал синей флуоресценции (при ~ 460 нм) от зонда CC2-DMPE. Деполяризация клетки, которая вызывает перемещение DISBAC ₂ (3) на внутреннюю сторону мембраны, как ожидается, приведет к снижению активности FRET.

Соединения лантанидов, такие как европий и тербий, эффективно использовались в качестве доноров в реакциях FRET. Эти соединения обеспечивают очень хорошее соотношение сигнал/шум в результате их длительного периода полураспада флуоресценции и спектральных характеристик. Излучение этих соединений имеет резко пиковый профиль с большим стоксовским сдвигом от возбуждения. Кроме того, длительный период полураспада флуоресценции позволяет начинать измерения после прекращения действия возбуждающего света. Задержка между возбуждением и измерением (диапазон мс) позволяет рассеять фоновую флуоресценцию органической акцепторной молекулы с периодом полураспада в наносекундном диапазоне. Таким образом, измеряется только донорно-акцепторное излучение, когда включена соответствующая задержка.

Молекула донора не всегда должна включать флуоресцентное соединение.Люминесцентные молекулы испускают фотоны способом, очень похожим на флуоресценцию. Основное отличие состоит в том, что электронное возбуждение является результатом не поглощения фотонов, а скорее высвобождения химической энергии, содержащейся внутри молекулы. Когда возбужденные электроны возвращаются к своей основной энергии, она может высвобождаться в виде фотона света или передаваться через RET к молекуле-акцептору, если условия правильные. Хотя количество молекул, которые можно использовать, ограничено, эта технология имеет то преимущество, что нет внешнего возбуждения молекулы-акцептора.

Проблемы

При разработке экспериментов FRET необходимо учитывать ряд вопросов. Самая очевидная проблема — это близость. В зависимости от дизайна анализа близость будет либо установлена, либо удалена во время анализа, что приведет к изменению сигнала, который можно измерить. Необходимо выбрать подходящие пары донор/акцептор. Пары должны иметь достаточное спектральное перекрытие для эффективной передачи энергии, но при этом иметь достаточную разницу в спектрах, чтобы их можно было отличить друг от друга.Выбор фильтров для выбора длины волны флуоресценции также имеет решающее значение для успеха или неудачи экспериментального обнаружения FRET. Возбуждающий фильтр для донора должен избирательно возбуждать молекулу донора, сводя к минимуму прямое возбуждение молекулы акцептора. Загрязнение прямого возбуждения акцепторной молекулы можно объяснить с помощью соответствующих контролей, но большие количества затруднят интерпретацию данных. Как показано на рисунке 1, фильтры, используемые для возбуждения Cy3, сводят к минимуму возбуждение Cy5, обеспечивая при этом достаточный сигнал возбуждения для Cy3.

Еще одна важная проблема, связанная с обнаружением FRET, связана с концентрацией аналита. Только те молекулы, которые взаимодействуют друг с другом, приведут к FRET. Если большое количество донорных и акцепторных молекул присутствует, но не взаимодействует, количество происходящих FRET будет довольно низким. В этом примере, хотя молекулы донора и акцептора могут быть очень легко обнаружены по отдельности, фактической активности FRET может быть недостаточно для обнаружения. Что касается FRET, фактически измеряемым «аналитом» являются пары донор/акцептор, а не отдельные компоненты.Кроме того, как донорные, так и акцепторные молекулы должны быть в достаточной концентрации, чтобы произошел FRET. Большинство событий связывания представляют собой динамический процесс, который достигает устойчивого состояния. Если одного из компонентов реакции не хватает, то общее связанное количество будет, естественно, низким. Например, временные трансфекции двумя разными генетическими элементами, которые приводят к тому, что один из элементов не транслируется эффективно в белок, приведут к низким уровням FRET. Клеточная локализация также может играть роль.Если одна молекула находится в цитоплазме, а другая молекула находится в ядре, взаимодействия друг с другом не будет, несмотря на достаточное количество каждого из них.

Применение FRET

• Структура и конформация белков [3]
• Пространственное распределение и сборка белков [4]
• Взаимодействие рецептор/лиганд [5]
• Иммуноанализ [6]
• Структура и конформация нуклеиновых кислот [7]
• ПЦР в реальном времени и обнаружение SNP [8,9]
• Гибридизация нуклеиновых кислот [10]
• Распределение и транспорт липидов [11]
• Анализы слияния мембран [12]
• Датчик мембранного потенциала [13, 14]
• Анализы флуорогенной протеазы [15]
• Индикаторы для циклического AMP [16]

Узнайте больше о Synergy HTX
Многорежимный считыватель

Каталожные номера

1. Фёрстер, Т. (1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция Ann. Физ. 2:55-75.
2. Циен, Р. (1998) Энн. Обзор Biochem, 67:509-544
3. Jonsson T, Waldburger CD, Sauer RT, (1996) Нелинейные соотношения свободной энергии в разворачивании репрессора Arc подразумевают существование нестабильных, нативных промежуточных продуктов сворачивания.». Biochemistry 35:4795-4802.
4. Уотсон Б.С., Хазлетт Т.Л., Экклстон Дж.Ф., Дэвис С., Джеймсон Д.М., Джонсон А.Е. (1995) Расположение макромолекул в аминоацил-тРНК.фактор элонгации тройной комплекс Tu.GTP. Исследование переноса энергии флуоресценции. Биохимия 34:7904-7912
5. Berger W, Prinz H, Striessnig J, Kang HC, Haugland R, Glossmann H. (1994) Сложный молекулярный механизм связывания дигидропиридина с Ca(2+)-каналами L-типа, выявленный с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции. Биохимия 33: 1875-11883.
6. Ханна П.Л., Ульман Э.Ф. (1980) 4′,5′-Диметокси-6-карбоксифлуоресцеин: новый акцептор переноса энергии флуоресценции с диполь-дипольной связью, полезный для иммунофлуоресцентных анализов. Анальный биохим 108:156-161.
7. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Лилли Д.М. (1994) Структура раствора четырехстороннего соединения ДНК в условиях с низким содержанием соли: анализ переноса энергии флуоресцентного резонанса. Биофиз J 66:99-109.
8. Ли Л.Г., Ливак К.Дж., Мулла Б., Грэм Р.Дж., Винаяк Р.С., Воуденберг ТМ. (1999) Семицветное гомогенное обнаружение шести продуктов ПЦР. Biotechniques 27:342-349.
.
9. Мякишев М.В., Хрипин Ю., Ху С., Хамер Д.Х. 2001) Высокопроизводительное генотипирование SNP с помощью аллель-специфичной ПЦР с универсальными праймерами, меченными переносом энергии.Геном рез. 11:163-169.
10. Паркхерст К.М., Паркхерст Л.Дж. (1995)Кинетические исследования переноса энергии флуоресцентного резонанса с использованием олигонуклеотида с двойной меткой: гибридизация с комплементом олигонуклеотида и с одноцепочечной ДНК. Биохимия 34:285-292.
11. Николс Дж.В., Пагано Р.Э. (1983) Резонансный анализ переноса энергии белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. J Biol Chem 258:5368-5371.
12. Uster PS (1993) In situ резонансная микроскопия переноса энергии: мониторинг слияния мембран в живых клетках.Методы Энзимол. 221:239-246.
13. Хоффман, Р. и Хелд, П. Примечание по применению BioTek.
14. Гонсалес Дж. Э., Цзянь Р.Ю. (1995)Определение напряжения с помощью переноса энергии флуоресцентного резонанса в одиночных клетках. Биофиз J 69: 1272-1280.
15. Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J. (1990) Новые флуорогенные субстраты для анализа ретровирусных протеаз методом резонансного переноса энергии. Science 247, 954-958.
16. . Адамс С.Р. и др. (1993) Оптические зонды для циклического АМФ, флуоресцентные и люминесцентные зонды для биологической активности, Mason WT, Ed.стр. 133-149.

Кем был Кевин Фрет? 5 вещей, которые нужно знать о гей-латиноамериканском трэп-исполнителе

Кевин Фрет был застрелен в 5:30 утра по местному времени в четверг (10 января) в Сантурсе, Пуэрто-Рико. Ему было 24 года.

Начинающий артист, начавший свою музыкальную карьеру в 2018 году с непримиримого трека «Soy Asi», по словам менеджера Эдуардо Родригеса, был «художником и великодушным мечтателем».

Fret как исполнителя гей-трэпа заключалась в том, чтобы изменить правила игры в музыкальной индустрии и вдохновить художников из ЛГБТ-сообщества сделать то же самое.

Вот все, что нужно знать о покойной восходящей звезде Пуэрто-Рико.

Fret начал петь на соревнованиях

Прежде чем начать свою музыкальную карьеру в 2018 году, Кевин Фрет участвовал в певческих конкурсах, таких как La Banda и Solo Tu Voz . Первое музыкальное видео, которое он выпустил, было «Soy Asi» в апреле прошлого года, что дало ему возможность выставить напоказ свою жестокую личность.Он также сотрудничал с Майклом Дюраном в «Diferente». В видео на Facebook Фрет указал, что ему нравится создавать противоречивую музыку, потому что он – настоящий, оригинальный и всегда «говорил по делу».

В его музыке было сообщение

Fret использовал свои платформы социальных сетей не только для того, чтобы делиться своей музыкой и ярким стилем моды. Покойный певец также выступил против своих ненавистников и привлек внимание к издевательствам. Как представитель ЛГБТ-сообщества, он хотел вдохновить начинающих артистов не бояться начинать свою музыкальную карьеру.

Фрет часто делился подробностями о своей личной жизни с поклонниками

В интервью радиоведущему iHeart Энрике Сантосу Фрет сказал, что стал геем в 18 лет. Сначала его родители не поддерживали его, но потом приняли его и стали его самыми большими поклонниками. У Фрета была младшая сестра по имени Дорианн, которая гордилась его карьерой, а также тем, что он представлял в музыкальной индустрии. В 2018 году Фрет также рассказал в видео на YouTube о своей операции по липосакции и увеличении ягодиц.

Ладу арестовали в 2018 году

Летом 2018 года он был арестован по обвинению в отягчающих обстоятельствах после драки в лифте в Майами, согласно отчету об аресте, направленному на NBC Майами . Фрет всегда использовал социальные сети, чтобы привлечь внимание к преступлениям на почве ненависти и обострениям, которые он получал из-за своей сексуальной ориентации.

У Лады большие планы на 2019 год

Хотя его жизнь оборвалась, всегда есть шанс, что семья Фрета поддержит посмертные релизы артиста.Видео, размещенное в Instagram музыкальным продюсером @Antrax_Official, показывает, что у Fret есть новая музыка в работе на 2019 год.

Amazon.com: Персонализированный набор свадебных фотоальбомов

Настраиваемый

Что-то пошло не так.Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Что-то пошло не так. Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Базовая цена указана за набор из трех букв. Каждый альбом содержит 100 фотографий размером 4 x 6 дюймов. Они не перезаправляемые. Прозрачные карманы загружаются сверху и безопасны для фотографий: не содержат кислоты и полипропилена. Размер каждого альбома 5 дюймов D x 6.5 дюймов в x 2,25 дюйма по внешней ширине переплета. *Аксессуары на фото не включены.

Дифференциальная динамика RhoA в мигрирующих и стационарных клетках, измеренная с помощью FRET и автоматизированного анализа изображений

Abstract

Генетически кодируемые биосенсоры на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) нашли широкое применение для изучения пространственно-временной регуляции молекулярной активности в живых клетках с высоким разрешением. Эффективная и точная количественная оценка большого количества данных визуализации из этих одноклеточных измерений FRET требует надежного и автоматизированного анализа данных. Однако нелинейное движение живых клеток представляет собой огромную проблему для этой задачи. На основе регистрации изображения движения одной клетки мы разработали автоматизированные методы анализа изображений для отслеживания и количественной оценки сигналов FRET в определенных пользователем субклеточных областях. Кроме того, субклеточные пиксели были классифицированы в соответствии с их связанными сигналами FRET и динамикой проанализированных кластеров.Результаты показали, что EGF-индуцированное снижение активности RhoA в мигрирующих клетках HeLa значительно меньше, чем в стационарных клетках. Кроме того, активность RhoA поляризована в мигрирующих клетках, при этом градиент полярности ориентирован в направлении, противоположном направлению миграции клеток. Напротив, наблюдается отсутствие последовательного предпочтения полярности RhoA среди стационарных клеток. Таким образом, наши методы анализа изображений могут предоставить мощные инструменты для высокопроизводительного и систематического исследования пространственно-временной молекулярной активности в регулировании функций живых клеток с их формой и положением, постоянно меняющимися во времени.

Образец цитирования: Eichorst JP, Lu S, Xu J, Wang Y (2008) Дифференциальная динамика RhoA в мигрирующих и стационарных клетках, измеренная с помощью FRET и автоматизированного анализа изображений. ПЛОС ОДИН 3(12): е4082. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082

Редактор: Terry Means, Massachusetts General Hospital/Harvard University, United States of America

Получено: 6 ноября 2008 г.; Принято: 26 ноября 2008 г .; Опубликовано: 30 декабря 2008 г.

Авторские права: © 2008 Eichorst et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана Отделом биоинженерии Университета Иллинойса, Урбана-Шампейн, Фондом Уоллеса Х. Коултера, Beckman Laser Institute Inc., грантом NSF 08-00870 и грантом NIH NS- 063405. Финансирующие агентства не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Миграция клеток играет важную роль в эмбриональном развитии, восстановлении тканей, инвазии рака и атеросклерозе [1]. Это высокоинтегрированный процесс, модулируемый несколькими сигнальными путями, состоящими из растяжения цитоскелета и формирования фокального комплекса спереди, а также разборки фокальной адгезии и сокращения цитоскелета сзади [1].Семейство малых Rho GTPases играет ключевую роль в регуляции актинового цитоскелета и, следовательно, миграции [1]–[3]. Эти GTPases функционируют как молекулярные переключатели в клетке, чередуя активные состояния, связанные с GTP, и неактивные состояния, связанные с GDP, опосредованные факторами обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) и белками, активирующими GTPase (GAP), соответственно [1]–[4]. Сообщалось, что среди известных членов малых Rho GTPases, таких как RhoA, Rac1 и Cdc42 [2], [3], RhoA опосредует сборку сократительных актомиозиновых филаментов в задней части мигрирующих клеток через один из своих нижестоящих эффекторов, ROCK. [3]–[5].Поэтому было высказано предположение, что активность RhoA может концентрироваться в хвосте мигрирующих клеток [3]. Однако при использовании биосенсоров, основанных на флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET) [6], недавно была обнаружена удивительно высокая активность RhoA не только в хвосте, но и в передней части мигрирующих клеток [7], [8]. Эти результаты предполагают, что RhoA может иметь разные функции в разных субклеточных местах.

FRET — явление квантовой механики. Когда два флуоресцентных белка (ФБ), донор и акцептор, находятся рядом с благоприятной ориентацией, возбуждение донорного ФП может вызвать эмиссию акцептора [9].FRET позволил разработать множество биосенсоров, способных обнаруживать молекулярную активность или белок-белковые взаимодействия в живых клетках [10], [11]. Два биосенсора RhoA на основе FRET были разработаны для визуализации пространственно-временной динамики активности RhoA в живых клетках [7], [12]. Группа Мацуда разработала биосенсор RhoA (Raichu-RhoA), который содержит RhoA (аминокислота 1–189), гибкий линкер и RhoA-связывающий (RBD) домен из молекулы субстрата PKN, объединенный между голубым и желтым флуоресцентным цветом. белок (CFP и YFP) [12].Активация RhoA может индуцировать внутримолекулярное связывание между RhoA и доменом RBD в биосенсоре. Результирующее конформационное изменение может сблизить CFP и YFP и усилить сигналы FRET. Биосенсор Raichu-RhoA позволил отслеживать активность RhoA во время клеточного деления, поляризации и оборота фокальной адгезии в разных клетках [8], [12]–[15]. Независимо был разработан другой биосенсор FRET RhoA, содержащий последовательно полноразмерный RhoA, CFP, гибкий линкер, YFP и RBD-домен ротекина [7].Этот биосенсор также успешно применялся для изучения различных клеточных функций, включая миграцию и полярность при хемотаксисе [7], [16], [17].

Несмотря на то, что разработка биосенсоров FRET значительно расширила наши знания о передаче сигналов в живых клетках, огромное количество данных изображений, получаемых этими биосенсорами, требует автоматических, интеллектуальных и объективных инструментов анализа изображений, позволяющих точно и эффективно интерпретировать биологическую информацию [1]. 18]. В частности, крайне необходимы эффективные алгоритмы для отслеживания движения клеток и учета различий в форме и геометрии отдельных клеток.

Регистрация изображений широко применяется в технике и науке для автоматического отслеживания движущихся объектов во времени и для нахождения попиксельного соответствия между двумя изображениями однотипных объектов [19], [20]. При анализе изображений живых клеток этот метод использовался для выравнивания путем простого перемещения и вращения флуоресцентных изображений на разных длинах волн [21]–[23] и изображений ядер в разные моменты времени одной и той же клетки [24]. Он также применялся для отслеживания флуоресцентных частиц внутри клеток [25].Более сложные методы регистрации изображений также применялись для анализа экспрессии генов in situ в мозге мышей [20]. Другие методы количественного определения были разработаны для изучения распределения белка и полярности молекулярной активности путем деления целой клетки на маленькие клинья в полярной системе координат [23], [26]–[28], для изучения подвижности и энергии белков. отдельные сперматозоиды путем отслеживания и захвата [29], [30] или для извлечения данных о трехмерной анатомии сосудов [31]. Тем не менее, автоматическая регистрация изображений движущихся клеток с помощью попиксельного отслеживания по-прежнему остро нуждается в высоком разрешении и эффективной количественной оценке молекулярных сигналов в пространстве и времени.

В этой статье мы разработали автоматизированные методы анализа изображений для отслеживания движения отдельных клеток и количественной оценки сигналов FRET в субклеточных областях с использованием биосенсора RhoA от доктора Мацуда [12]. Пространственно-временные паттерны активации RhoA анализировали в мигрирующих и стационарных клетках HeLa в ответ на стимуляцию фактором роста. Наши результаты показывают, что глобальная активность RhoA в мигрирующих клетках подавлялась в ответ на стимуляцию фактором роста в меньшей степени, чем в стационарных клетках.Активность RhoA была более сконцентрирована в противоположном направлении миграции в мигрирующих клетках, но не проявляла предпочтения в стационарных клетках.

Материалы и методы

Клеточные линии и культуры

HeLa (АТСС, Манассас, Вирджиния) культивировали во влажном инкубаторе ₂ с 95% воздуха, 5% СО ₂ при 37°С. Культуральной средой была модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия. Реагенты для культивирования клеток были получены от Invitrogen (Сан-Диего, Калифорния).

Временная трансфекция и визуализация под микроскопом

Поскольку биосенсор Raichu-RhoA легко трансфицируется и хорошо охарактеризован для клеток HeLa, мы использовали этот биосенсор для визуализации динамики активности RhoA в клетках HeLa на покрытом фибронектином стекле [12]. Биосенсор Raichu-RhoA трансфицировали в HeLa с помощью Lipofectamine (Invitrogen) [12] перед голоданием 0,5% FBS в течение 36–48 часов.Затем клетки суспендировали в трипсин-ЭДТА и высевали на чашки со стеклянным дном, покрытые фибронектином, на 3–6 часов перед стимуляцией EGF (50 нг/мл). Во время визуализации клетки содержали в СО ₂ -независимой среде без сыворотки (Invitrogen) при 37°С. Фокус объектива был направлен вблизи базальной стороны клетки. Изображения собирали с помощью аксиовертного инвертированного микроскопа Zeiss с фильтром возбуждения 420DF20, дихроичным зеркалом 450DRLP, двумя эмиссионными фильтрами, управляемыми устройством смены фильтра (480DF30 для CFP и 535DF25 для YFP), и охлаждаемой камерой прибора с зарядовой связью (Cascade 512B; Фотометрия). Интенсивность возбуждающего света контролировалась регулируемыми фильтрами нейтральной плотности, чтобы обеспечить минимальное фотообесцвечивание во время визуализации. Изображения интенсивности флуоресценции CFP и YFP вычитали из фона. Изображения отношения FRET были рассчитаны путем расчета отношения CFP/YFP по пикселям для представления активности RhoA в пространстве и времени с использованием программного обеспечения MetaFluor 6.2 (Universal Imaging) или наших специализированных программ, разработанных в MATLAB (MathWorks).

Регистрация изображения

Для автоматической регистрации цейтраферных изображений движущейся клетки мы сопоставили эти клеточные изображения в единичный диск, который служил эталонным изображением как для регистрации последовательности цейтраферных изображений той же клетки, так и для сравнения между разные клетки разной формы.Потребовалось четыре шага, чтобы сопоставить ячейку с единичным диском. Во-первых, тело клетки определяли путем сегментации. Во-вторых, контрольные точки на ячейке вычислялись с помощью триангуляции Делоне выпуклой оболочки тела ячейки. В-третьих, контрольные точки были сопоставлены с эталонным изображением (единичным диском) путем вычисления относительного положения точек в выпуклой оболочке. Наконец, ячейки были отображены в единичный диск с помощью кусочно-линейного преобразования [32], определяемого контрольными точками и триангуляцией Делоне (рис. 1).

Рис. 1. Диаграммы, изображающие алгоритм отслеживания регионов.

(A) Центроид ячейки ( C ), контрольная точка ( P ) и пересечение границы на выпуклой оболочке ( E , на левом изображении) использовались для вычисления относительного расстояния и ориентация вектора, указывающего от центроида к контрольной точке. ( r , θ ) — полярная координата точки на единичном диске ( P′ ), соответствующей контрольной точке ( P ) на изображении ячейки (правое изображение).(B) Процесс регистрации показан слева направо. Сначала ячейка разбивается на треугольную сетку внутри ее границы. Во-вторых, сетка была сопоставлена ​​с единичным кругом путем вычисления относительного расстояния и ориентации векторов, указывающих от центроида к узлам сетки (или контрольным точкам). Наконец, контрольные точки и изображение ячейки были сопоставлены с единичным диском с помощью кусочно-линейной интерполяции внутри треугольной сетки. (C) Верхние панели показывают изображения одной клетки, подвергающейся расширению или перемещению, с выбранной областью интереса в первом кадре.На нижних панелях показаны единичные диски, преобразованные из ячейки в разные моменты времени. Граница преобразованной области интереса в первом кадре используется для отслеживания и количественной оценки сигналов из одной и той же области в этих разных единичных дисках.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g001

Метод Оцу [33] был использован для вычисления порога интенсивности для сегментации тела клетки, поскольку флуоресцентные изображения, зарегистрированные с помощью биосенсора RhoA, были яркими и легко отделимыми от фона. Список узлов, очерчивающих контур ячейки, был сгенерирован на основе идентифицированного тела ячейки. Таким образом, внутри контура было создано изображение маски, представляющее форму клетки. Изображения, полученные из канала YFP, использовались для обнаружения края ячейки и маски, поскольку они были ярче, чем изображения из канала CFP.

Для однозначной регистрации формы ячейки по единичному кругу требуется, чтобы форма ячейки была выпуклой. Поэтому выпуклая оболочка, описывающая изображение клеточной маски, была рассчитана [34] и использована в качестве границы для вычисления триангуляции Делоне [35].Затем узлы триангуляции использовались в качестве контрольных точек для изображения клетки. Для каждой контрольной точки на изображении ячейки вычислялась соответствующая контрольная точка в единичном диске на основе ее относительного положения в выпуклой оболочке. Вкратце, центр тяжести ячейки () был сопоставлен с центром единичного диска () (рис. 1А). Для любой другой контрольной точки () соответствующая точка на единичном круге вычислялась на основе относительного положения точки между центроидом и краем выпуклой оболочки. Предположим, что имеет полярные координаты () с центром в центре тяжести ; и луч от до пересекает ребро выпуклой оболочки в точке . Тогда полярные координаты соответствующей точки () в единичном круге задаются () с центром в , где представляет собой относительное расстояние от до , т.е. (рис. 1A-B). И наоборот, любая точка единичного диска может быть отображена обратно на разные ячейки или на одну и ту же ячейку с разными формами в разные моменты времени.

Выпуклая оболочка всей ячейки отображалась на единичный круг кусочно-линейным преобразованием [32].Внутри каждого треугольника в триангуляции Делоне преобразование является линейным и однозначно определяется тремя контрольными точками, являющимися узлами треугольника (рис. 1В). Преобразование также непрерывно на ребрах, общих для двух треугольников.

Отслеживание областей интереса (ROI)

Чтобы отслеживать интересующие области, замедленные изображения одной клетки сначала были преобразованы в серию единичных дисков. Затем пользователь выбирал одну или несколько областей интереса и определял их на первом изображении ячейки.После этого была сгенерирована маска для ROI и сопоставлена ​​с первым единичным диском с помощью нашего метода регистрации изображений. Для отслеживания среднего сигнала FRET в этой области предполагалось, что маска ROI на единичном диске остается в одном и том же месте во времени (рис. 1C). Таким образом, одна и та же маска может быть применена ко всем единичным изображениям дисков для отслеживания и расчета временной динамики среднего отношения FRET в выбранной области (областях), которая была рассчитана путем использования отношения общей интенсивности CFP и интенсивности YFP в области. (s) в клетке (рис. 1C).Предположение о постоянных ROI в дисках эталонных единиц является точным, если клетки перемещаются только в плоскости изображения или сжимаются/расширяются в радиальных направлениях, идущих от центроида. Не ожидалось, что клетки будут вращаться вокруг своих центроидов в ходе эксперимента. Эти предположения разумны для клеток с медленной миграцией в пределах временного окна наших экспериментов и согласуются с моделью градиентного радиального растяжения (GRE) [36], где ожидалось, что клетки будут расширять или втягивать свои ламеллоподии локально перпендикулярно краю клетки и вдоль актиновые волокна.

ROI на эталонном диске были сопоставлены с исходными изображениями клеток, чтобы визуально подтвердить, что они действительно могут отслеживать реальную область в мигрирующих клетках (рис. 1C). Для повышения вычислительной эффективности только узлы, очерчивающие ROI на единичном диске, но не вся маска, были преобразованы обратно в изображения ячеек.

Кластерный анализ

Для изучения геометрических особенностей субклеточных областей с аналогичными уровнями активности RhoA пиксели изображения клеток были классифицированы и разделены на шесть кластеров в соответствии со значениями отношения RhoA FRET.Функция MATLAB kmeans использовалась для классификации пикселей по разным кластерам путем минимизации вариации значений FRET внутри кластера [37], [38]. В результате каждый кластер содержал пиксели с близкими значениями коэффициента FRET.

Программы MATLAB, реализующие эти функции, можно получить, написав соответствующему автору этой статьи.

Результаты

Регистрация изображения

В ходе экспериментов наблюдались два класса клеток HeLa со значительно различающимися моделями миграции: мигрирующие и стационарные.Чтобы определить, была ли клетка HeLa мигрирующей или стационарной, местоположение ее центроида отслеживали во времени. Наибольшее расстояние, пройденное центроидом от начального положения, было разделено на сумму расстояний, пройденных на каждом временном шаге в течение примерно 60 минут в каждом эксперименте. При соотношении больше или равном 0,5 клетка считалась мигрирующей. В противном случае ячейка считалась стационарной. Результаты подтвердили, что явно существует два класса клеток HeLa с отношением расстояний, равным 0.71 и 0,1867 (табл. 1). Направление миграции каждой мигрирующей клетки можно определить по траектории ее центроида с помощью линейной аппроксимации.

С помощью нашего метода регистрации изображений внутриклеточная активность RhoA при стимуляции фактора роста может быть визуализирована в едином эталонном кадре изображения (рис. 2). Активность RhoA была высокой как на переднем, так и на заднем крае мигрирующих клеток (рис. 2А-2В). Это подтвердило, что RhoA вносит вклад в удлинение актиновых филаментов и взъерошивание мембраны на клеточном фронте через mDia, тогда как регулирует сократимость актомиозина на клеточном тыле [2].Как в мигрирующих, так и в стационарных клетках можно четко наблюдать пространственные паттерны двух концентрических кольцеобразных субклеточных структур с высокой активностью RhoA (рис. 2 и фильм S1). Внешнее кольцо с высокой активностью RhoA может представлять зарождающуюся и динамическую активацию интегрина при активности RhoA [39]. Высокая активность RhoA во внутреннем кольце может указывать на относительно высокий стресс, возникающий в конвергентной зоне, где ретроградный поток актина ламеллы встречается с антероградным потоком актина тела клетки [40]. Несмотря на эти отличительные субклеточные особенности, общая активность RhoA как мигрирующих, так и немигрирующих клеток HeLa снижалась после стимуляции EGF (рис. 2 и фильм S1). Похоже, что при стимуляции EGF активность RhoA оставалась относительно стабильной в задней части мигрирующих, но не стационарных клеток (рис. 2B и фильм S1).

Рис. 2. FRET-изображения и их преобразованные карты на единичных дисках биосенсора Raichu-RhoA (Venus/ECFP) в мигрирующих и стационарных клетках.

На панели (A) показана последовательность замедленных изображений FRET для репрезентативной мигрирующей клетки HeLa. Белая стрелка указывает направление миграции. Панель (B) показывает изображения FRET мигрирующей клетки в (A), преобразованной в единичный диск. Пространственно-временная динамика изображений FRET движущейся клетки HeLa также показана в фильме S1. На панели (C) показана последовательность покадровых изображений FRET для репрезентативной стационарной клетки HeLa. Панель (D) показывает изображения FRET стационарной ячейки в (B), преобразованной в единичный диск.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g002

Отслеживание областей интереса

Для отслеживания и количественной оценки локальной активности RhoA в субклеточных областях клеток HeLa были выбраны четыре ROI как в мигрирующих, так и в стационарных клетках. Четыре области интереса в мигрирующих ячейках охватывают переднюю, заднюю и две стороны ячейки (рис. 3А и фильм S2). Поскольку ROI может перемещаться из тела клетки (рис. 3A, область 1), пороговое значение YFP-изображения клетки использовалось для оценки и расчета сигнала FRET в пределах части ROI внутри тела клетки.Поэтому были рассчитаны средние отношения FRET в каждой области интереса мигрирующих клеток в разные моменты времени для мониторинга динамической активности RhoA в субклеточных местах (рис. 3B). Оказалось, что активность RhoA во всех четырех областях сразу же падала и немного восстанавливалась после стимуляции EGF. Затем локальная активность RhoA непрерывно снижалась в областях спереди и с обеих сторон. Однако в области вблизи заднего края мигрирующей клетки активность RhoA оставалась относительно постоянной без значительного подавления после стимуляции EGF (рис. 3В).Это репрезентативная особенность среди различных проанализированных мигрирующих клеток. В результате разница между активностью ROI вблизи передней и задней части клетки показала значительное увеличение для мигрирующих клеток. Это открытие подтверждает предыдущее исследование, что высокая активность RhoA важна для обеспечения сокращения хвоста мигрирующих клеток [2].

Рисунок 3. Отслеживание и анализ активности RhoA в различных ROI мигрирующей клетки HeLa.

(A) Слева: в первом кадре были выбраны четыре области интереса для мониторинга активности RhoA спереди, сзади и с двух сторон мигрирующей клетки.Справа: вычисленные контуры и расположение ROI в ячейке в разные моменты времени на основе нашего алгоритма отслеживания. Покадровые изображения автоматически отслеживаемых областей интереса также показаны в фильме S2. (B) Временные графики коэффициентов FRET биосенсора Raichu-RhoA, усредненные по четырем ROI, показанным на (A).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g003

В стационарных ячейках, поскольку клетки не двигались значительно, положения ROI оставались относительно неизменными во времени (рис. 4A).Активность RhoA во всех четырех областях сразу упала и немного восстановилась, прежде чем продолжить снижение после стимуляции EGF. В отличие от субклеточных различий активности RhoA, наблюдаемых в мигрирующих клетках, активность RhoA во всех четырех ROI стационарных клеток, по-видимому, снижалась со сходной кинетикой при стимуляции EGF (рис. 4).

Рисунок 4. Отслеживание и анализ активности RhoA в различных областях интереса стационарной клетки HeLa.

(A) Слева: на первом кадре были выбраны четыре области интереса для мониторинга активности RhoA спереди, сзади и с двух сторон неподвижной клетки.Справа: вычисленные контуры и расположение ROI в ячейке в разные моменты времени на основе нашего алгоритма отслеживания. (B) Временные графики коэффициентов FRET биосенсора Raichu-RhoA, усредненные по четырем ROI, показанным на (A).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g004

Из-за относительно стабильной активности RhoA в хвосте мигрирующих клеток при стимуляции EGF ожидалось, что глобальная активность RhoA в мигрирующих клетках будет снижаться медленнее. чем у стационарных ячеек.Следовательно, мы количественно оценили глобальную активность биосенсора RhoA в мигрирующих и стационарных клетках, взяв среднее значение активности RhoA во всех четырех ROI и нормализовав в соответствии с их отношениями до EGF. Результаты подтвердили, что активность RhoA снижалась как в мигрирующих, так и в стационарных клетках под воздействием EGF, причем в мигрирующих клетках медленнее, чем в стационарных клетках (рис. 5). Разница между нормализованными соотношениями биосенсора RhoA в мигрирующих и стационарных клетках становится статистически значимой через 13–26 минут после стимуляции EGF (рис. 5), что соответствует времени, когда активность RhoA в хвосте мигрирующих клеток начинает проявляться. из других субклеточных областей (примерно через 25 минут после EGF на рисунке 3B).Эта разница между мигрирующими и стационарными клетками продолжала увеличиваться во времени после стимуляции EGF (рис. 5). Эти результаты показывают, что активность RhoA в мигрирующих клетках при стимуляции EGF по-разному снижается по сравнению с таковой в стационарных клетках, возможно, из-за относительно высокой активности RhoA в задней части мигрирующих клеток после стимуляции EGF.

Рис. 5. Общая активность RhoA в мигрирующих и стационарных клетках HeLa в разные моменты времени до и после стимуляции EGF.

Активность RhoA, усредненная по четырем ROI, охватывающим все тело клетки, использовалась для представления глобальной активности RhoA. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку, а звездочки отмечают моменты времени, когда средняя активность RhoA значительно различалась (t-test, p<0,05) между мигрирующими и стационарными клетками.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g005

Кластерный анализ

Мы дополнительно изучили геометрические особенности субклеточных областей с относительно высокой активностью RhoA после стимуляции EGF.Внутриклеточные пиксели на FRET-изображении были разделены на шесть кластеров в соответствии со значениями их отношения FRET. Как показано на рисунке 6A, пиксели на изображении были закодированы цветом кластера, к которому они принадлежат, в порядке от синего до красного в соответствии со средним отношением RhoA FRET в каждом кластере в диапазоне от низкого до высокого. Три верхних кластера с самым высоким коэффициентом FRET были выбраны и отслежены для изучения распределения высокой активности RhoA и их влияния на поведение клеток, например. миграция (рис. 6 и фильм S3).Программа MATLAB была разработана для автоматического выбора и количественной оценки площади этих регионов (рис. 6). Результаты показали, что размер площади этих выбранных областей увеличивался со временем после стимуляции EGF, особенно в задней части мигрирующих клеток (рис. 6C). Для количественного анализа размера этих областей с высокой активностью RhoA была установлена ​​полярная система координат с центром в центре тяжести каждой клетки. Затем ячейка была разделена на 18 угловых клиньев с шагом 20° (рис. 6В).Было рассчитано количество пикселей во всем клине, а также количество пикселей в пределах трех кластеров с высоким RhoA в клине, . Нормализованное количество пикселей в каждом клине рассчитывалось по соотношению . Нормализованное количество пикселей в каждом клине было нанесено на график в зависимости от угла клина, чтобы представить полярность активности RhoA. Как показано на рисунке 6D, эта кривая полярности репрезентативной мигрирующей клетки HeLa в разные моменты времени четко демонстрирует повышенную пространственную полярность RhoA, инициированную стимуляцией EGF.Пиксели с относительно высокой активностью RhoA, по-видимому, накапливались в области, противоположной направлению миграции, примерно под углом 220° по координатам на рис. 6Б.

Рисунок 6. Кластерный анализ активности RhoA в репрезентативной мигрирующей клетке.

(A) Шесть субклеточных областей с различной активностью RhoA были рассчитаны с использованием кластерного анализа K-средних. Эти области имеют цветовую кодировку в соответствии с их активностью RhoA, при этом холодные и горячие цвета указывают на низкий и высокий уровни активности RhoA соответственно.Направление миграции указано белой стрелкой. (B) Три области с самыми высокими отношениями RhoA FRET из панели (A) выбраны и продемонстрированы. Белые пунктирные линии очерчивают клин в ячейке. Система координат, используемая для полярного анализа, показана в правом нижнем углу. (C) Покадровые изображения, показывающие три кластера с высоким коэффициентом FRET до и после стимуляции EGF. На вставке показано положение кластера с самым высоким коэффициентом FRET, который обычно расположен на самом краю ячейки.(D) Ячейка была разделена на 18 клиньев, как показано на панели (B). Количество пикселей в трех кластерах с самым высоким коэффициентом FRET в каждом клине было нормализовано путем деления общего количества пикселей в клине. Это нормализованное количество пикселей high-FRET на клин отображается в зависимости от угла клина. Динамическое поведение автоматически обнаруженных кластеров также показано в фильме S3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g006

Аналогичный кластерный анализ был проведен на стационарных ячейках.Репрезентативная стационарная ячейка с шестью кластерами имеет цветовую кодировку по отношению FRET и изображена на рисунке 7A, а три самых высоких кластера и их замедленные изображения показаны на рисунках 7B и 7C соответственно. Нормализованное количество клиновидных пикселей под разными углами было количественно определено и нанесено на график в зависимости от угла на рисунке 7D. Результат указывает на отсутствие значительного процесса поляризации при стимуляции EGF в стационарных клетках.

Усредненные результаты полярности нескольких мигрирующих клеток были рассчитаны путем выравнивания их направления движения по одному и тому же углу.Через 52 минуты после ЭФР нормализованное количество пикселей с высокой активностью RhoA в каждом угловом клине четко демонстрировало поляризованный рисунок, при этом большее количество пикселей накапливалось позади мигрирующих клеток (рис. 8А). Напротив, распределение областей с более высокой активностью RhoA оказалось более случайным в стационарных клетках (рис. 8B). Все эти результаты свидетельствуют о том, что поляризация активности RhoA в клетках HeLa играет важную роль в регуляции клеточной миграции и ее направлений.

Рисунок 8.Сравнение субклеточного распределения активности RhoA между стационарными и мигрирующими клетками после стимуляции EGF.

Нормализованное количество пикселей high-FRET в каждом клине нанесено на график в зависимости от угла клина для множественных (A) мигрирующих и (B) стационарных клеток через 52 минуты после стимуляции EGF. Столбики погрешностей представляют стандартные значения ошибок. Мигрирующие клетки поворачивали и выравнивали так, чтобы они имели одинаковое направление миграции. Переднее и заднее направления миграции определялись относительным расположением клиньев относительно их соответствующих центроидов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082. g008

Обсуждение

Недавнее развитие технологий визуализации живых клеток предоставило множество мощных инструментов и позволило собрать огромное количество данных изображений/видеофильмов, что требует значительных затрат времени и усилий на анализ изображений и количественную оценку. Однако не хватает удобных и автоматизированных инструментов анализа изображений с высокой пропускной способностью. Мы разработали алгоритмы и методы анализа изображений, основанные на регистрации изображений, для отслеживания сложного движения мигрирующих клеток.Эти методы были применены для автоматического отслеживания и количественной оценки соотношения FRET биосенсора Raichu-RhoA во времени в субклеточных областях живых клеток HeLa, а также для анализа полярности внутриклеточных областей с высокой активностью RhoA. Результаты предполагают, что субклеточное распределение высокой активности RhoA по-разному регулируется в мигрирующих и стационарных клетках. Эти методы также могут применяться для анализа общих флуоресцентных изображений сигнальной трансдукции в живых клетках и обеспечивают автоматизированную, эффективную и объективную количественную оценку большого количества данных визуализации.

Методы анализа изображений, представленные в этой статье, полностью автоматизированы. Поскольку области интереса автоматически отслеживались в движущихся ячейках, пользователям нужно только определить начальные интересующие области на первом изображении ячейки. Для каждого кадра с четырьмя ROI требуется несколько секунд для количественного определения отношения FRET на персональном компьютере. Автоматизация такого рода анализа имеет решающее значение, поскольку на текущем этапе большая часть анализа данных для FRET-визуализации в живых клетках выполнялась вручную с контурами ROI, перемещаемыми биологом, если клетка перемещается или меняет форму.Это ручное отслеживание ROI для живых клеток может привести к низкой эффективности, утомительности и неточности. С нашим методом анализа отслеживание в целом очень надежно, если ROI были выбраны внутри тела ячейки и вдали от края ячейки. Поскольку выпуклая оболочка или контур ячейки, а не фактический край ячейки, были сопоставлены с единичным диском, этот метод стал бы менее точным, если область интереса была близка к некоторым краям ячейки, которые меняют свою форму с вогнутой на выпуклую. Дальнейшее совершенствование метода автоматизированного отслеживания потребует разработки и реализации более сложного алгоритма регистрации изображений.Тем не менее, преобразование различных ячеек в единую схему, такую ​​как единичный диск, должно быть полезным и важным для стандартизации и сравнения сигналов от каждой отдельной ячейки.

Применение нового метода кластерного анализа полезно для анализа и количественной оценки внутриклеточного распределения и полярности активности RhoA. Абсолютное значение активности RhoA не представляло очевидной картины полярности. Однако наблюдалось значительное увеличение количества пикселей с относительно более высокой активностью RhoA в хвосте мигрирующих клеток при стимуляции EGF, о чем свидетельствует количественная оценка с использованием автоматического кластерного анализа (рис. 6D).Это хорошо скоординированное распределение активности RhoA в пространстве, вероятно, может способствовать и контролировать направление миграции клеток. Концентрированное накопление высокой активности RhoA в задней части клетки может способствовать отделению клеточного хвоста от субстрата во время миграции [41], возможно, за счет активации расположенной ниже по течению молекулы ROCK, которая контролирует фосфорилирование киназы легкой цепи миозина (MLCK) и фосфатазы (41). MLCP) для регуляции сократительной способности актомиозина [5]. Ингибированная активность RhoA в направлении миграции клеток может приводить к активации Rac1 [42], небольшой ГТФазы, контролирующей выпячивание клеток и образование ламеллиподий [43].Как таковые, клетки могут координировано мигрировать в направлении, противоположном полярности RhoA.

Сравнение результатов для мигрирующих и стационарных клеток выявило различные пространственные паттерны активности RhoA в этих двух типах клеток. В отличие от поляризованной активности RhoA в мигрирующих клетках, глобальное подавление активности RhoA в стационарных клетках при стимуляции EGF может способствовать выпячиванию во всех направлениях без дискриминации, что предотвращает персистентную и направленную миграцию.Глобальное изменение активности RhoA при стимуляции EGF в мигрирующих клетках оказалось менее значительным по сравнению с таковым в стационарных клетках. Во многом это связано с постоянным поддержанием высокой активности RhoA на заднем крае мигрирующих клеток, но не в стационарных клетках. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения подробного молекулярного механизма, управляющего дифференциальными ответами RhoA стационарных и мигрирующих клеток.

Таким образом, наш метод анализа изображений может обеспечить высокопроизводительные и автоматизированные средства для количественной оценки и анализа пространственно-временных молекулярных сигналов в живых клетках.Это особенно эффективно при анализе большого количества сигналов от ячеек с изменяющейся формой, например, мигрирующие клетки. Далее мы продемонстрировали значение этого метода, применив его для количественной оценки динамической активности RhoA на субклеточном уровне в мигрирующих и стационарных клетках HeLa. Результаты показали, что EGF индуцирует подавление RhoA как в мигрирующих, так и в стационарных клетках HeLa. Однако поляризованное распределение активности RhoA устойчиво наблюдается только в мигрирующих, но не в стационарных клетках.

Дополнительная информация

Фильм S1.

Образы FRET сопоставлены с диском. Пространственно-временная динамика отношения FRET, представляющая активность RhoA при стимуляции EGF, показана в типичной мигрирующей клетке (слева) и эталонных изображениях, нанесенных на карту (справа). Красный и синий цвета указывают на высокую и низкую активность RhoA соответственно. Было показано, что клетка мигрирует в поле зрения, особенно в более поздней части видео (слева), в то время как эталонные изображения клетки остаются в пределах статического единичного диска (справа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.s001

(9,81 МБ MOV)

Фильм S3.

Геометрические особенности шести кластеров (справа) и трех верхних кластеров (слева) в мигрирующей ячейке показаны во времени. Эти области имеют цветовую кодировку в соответствии с их активностью RhoA, при этом холодные и горячие цвета представляют области с низким и высоким уровнями активности RhoA соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.s003

(10,26 МБ MOV)

Благодарности

Мы благодарим доктора. Митиюки Мацуда за ценные реагенты и конструкции.

Авторские взносы

Идея и разработка экспериментов: JPE SL YW. Провели эксперименты: JX. Проанализированы данные: JPE SL YW. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: JPE SL. Написал статью: JPE SL YW.

Каталожные номера

1. 1. Ридли А.Дж., Шварц М.А., Берридж К., Фиртел Р.А., Гинзберг М.Х. и соавт. (2003) Миграция клеток: интеграция сигналов спереди назад. Наука 302: 1704–1709.
2. 2. Jaffe AB, Hall A (2005) Rho GTPases: биохимия и биология. Annu Rev Cell Dev Biol 21: 247–269.
3. 3. Raftopoulou M, Hall A (2004) Миграция клеток: лидируют Rho GTPases. Дев Биол 265: 23–32.
4. 4. Wheeler AP, Ridley AJ (2004) Почему три белка Rho? RhoA, RhoB, RhoC и подвижность клеток. Exp Cell Res 301: 43–49.
5. 5. Риенто К., Ридли А.Дж. (2003) Скалы: многофункциональные киназы в поведении клеток.Nat Rev Mol Cell Biol 4: 446–456.
6. 6. Zhang J, Campbell RE, Ting AY, Tsien RY (2002) Создание новых флуоресцентных зондов для клеточной биологии. Nat Rev Mol Cell Biol 3: 906–918.
7. 7. Перц О., Ходжсон Л., Клемке Р.Л., Хан К.М. (2006)Пространственно-временная динамика активности RhoA в мигрирующих клетках. Природа 440: 1069–1072.
8. 8. Курокава К., Мацуда М. (2005)Локальная активация RhoA как требование для индукции взъерошивания мембраны. Мол Биол Ячейка 16: 4294–4303.
9. 9. Цзянь Р.Ю. (1998) Зеленый флуоресцентный белок. Annu Rev Biochem 67: 509–544.
10. 10. Wang Y, Shyy JY-J, Chien S (2008) Флуоресцентные белки, визуализация живых клеток и механобиология: видеть значит верить. Annu Rev Biomed Eng 10: В печати.
11. 11. Palmer AE, Jin C, Reed JC, Tsien RY (2004)Опосредованные Bcl-2 изменения в эндоплазматическом ретикулуме Ca2+ проанализированы с помощью улучшенного генетически кодируемого флуоресцентного датчика. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 17404–17409.
12. 12. Йошизаки Х., Охба Ю., Курокава К., Ито Р.Э., Накамура Т. и др. (2003)Активность ГТФаз Rho-семейства во время клеточного деления, визуализированная с помощью зондов на основе FRET. J Cell Biol 162: 223–232.
13. 13. Yoshizaki H, Ohba Y, Parrini MC, Dulyaninova NG, Bresnick AR, et al. (2004) Регуляция активности RhoA во время цитокинеза в зависимости от типа клеток. J Biol Chem 279: 44756–44762.
14. 14. Nakamura T, Aoki K, Matsuda M (2005) FRET-визуализация конусов роста нервов выявляет высокий уровень активности RhoA в периферическом домене.Brain Res Mol Brain Res 139: 277–287.
15. 15. Ямана Н., Аракава Ю., Нишино Т., Курокава К., Танджи М. и др. (2006)Путь Rho-mDia1 регулирует клеточную полярность и оборот фокальной адгезии в мигрирующих клетках посредством мобилизации Apc и c-Src. Mol Cell Biol 26: 6844–6858.
16. 16. Эль-Сибай М., Перц О., Панг Х. , Йип С.К., Лоренц М. и др. (2008)Опосредованное RhoA/ROCK переключение между Cdc42- и Rac1-зависимым выпячиванием в клетках карциномы MTLn3. Exp Cell Res 314: 1540–1552.
17. 17. Вонг К., Перц О., Хан К., Борн Х. (2006)Поляризация нейтрофилов: пространственно-временная динамика активности RhoA поддерживает механизм самоорганизации. Proc Natl Acad Sci USA 103: 3639–3644.
18. 18. Wang Y, Shyy JY-J, Chien S (2008) Флуоресцентные белки, визуализация живых клеток и механобиология: видеть значит верить. Ежегодный обзор биомедицинской инженерии 10: 1–38.
19. 19. Зитова Б., Флюссер Дж. (2003) Методы регистрации изображений: обзор.Вычисление изображения и зрения 21: 977–1000.
20. 20. Jagalur M, Pal C, Learned-Miller E, Zoeller RT, Kulp D (2007) Анализ экспрессии генов in situ в мозге мыши с регистрацией изображений, выделением признаков и кластеризацией блоков. BMC Bioinformatics 8: Приложение 10S5.
21. 21. Чемберлен К. Е., Крайнов В.С., Хан К.М. (2000) Визуализация пространственно-временной динамики активации Rac in vivo с помощью FLAIR. Методы Enzymol 325: 389–400.
22. 22. Ходжсон Л., Налбант П., Шен Ф., Хан К. (2006)Визуализация и коррекция фотообесцвечивания Mero-CBD, датчик эндогенной активации Cdc42.Методы Enzymol 406: 140–156.
23. 23. Шен Ф., Ходжсон Л., Рабинович А., Перц О., Хан К. и соавт. (2006) Функциональная протеометрия миграции клеток. Цитометрия А 69: 563–572.
24. 24. Ригер Б., Моленаар С., Диркс Р.В., Ван Влит Л.Дж. (2004)Выравнивание клеточного ядра из меченых белков только для 4D-визуализации in vivo. Microsc Res Tech 64: 142–150.
25. 25. Матула П., Матула П., Козубек М., Дворжак В. (2006)Быстрое точечное трехмерное выравнивание живых клеток.Процесс преобразования изображений IEEE 15: 2388–2396.
26. 26. Dormann D, Libotte T, Weijer CJ, Bretschneider T (2002)Одновременная количественная оценка подвижности клеток и белково-мембранной ассоциации с использованием активных контуров. Cell Motil Cytoskeleton 52: 221–230.
27. 27. Дубин-Талер Б.Дж., Джанноне Г., Доберейнер Х.Г., Шитц М.П. (2004) Нанометровый анализ распределения клеток на поверхностях с матриксным покрытием выявил два различных состояния клеток и ЭТАПЫ. Биофиз J 86: 1794–1806.
28. 28.Mott RE, Helmke BP (2007) Картирование динамики структурных изменений, вызванных сдвиговым напряжением, в эндотелиальных клетках. Am J Physiol Cell Physiol 293: C1616–1626.
29. 29. Ши Л.З., Насименто Дж.М., Бернс М.В., Ботвиник Э.Л. (2006) Компьютерное отслеживание отдельных сперматозоидов. J Biomed Opt 11: 054009.
30. 30. Shi LZ, Nascimento JM, Chandsawangbhuwana C, Botvinick EL, Berns MW (2008)Автоматическая система для изучения подвижности и энергетики сперматозоидов. Биомед микроустройства 10: 573–583.
31. 31. Wischgoll T, Choy JS, Ritman EL, Kassab GS (2008) Валидация основанного на изображениях метода извлечения коронарной морфометрии. Энн Биомед Инг 36: 356–368.
32. 32. Гоштасби А. (1986) Кусочно-линейные функции отображения для регистрации изображений. Распознавание образов 19: 459–466.
33. 33. Оцу Н. (1979) Метод выбора порога на основе гистограмм серого. Транзакции IEEE по системам, человеку и кибернетике 9: 62–66.
34. 34.Барбер К.Б., Добкин Д.П., Хухданпаа Х (1996) Алгоритм quickhull для выпуклых оболочек. Транзакции ACM по математическому программному обеспечению 22: 469–483.
35. 35. Джордж П.Л. (1991) Автоматическое создание сетки: применение к методам конечных элементов. Нью-Йорк: Уайли.
36. 36. Ли Дж., Исихара А., Териот Дж. А., Якобсон К. (1993) Принципы передвижения клеток простой формы. Природа 362: 167–171.
37. 37. Spath H (1985) Рассечение и анализ кластера: теория, программы FORTRAN, примеры.Гольдшмидт Дж., переводчик, редактор. Нью-Йорк: Halsted Press..
38. 38. Seber GAF (1984) Многомерные наблюдения. Барнетт В., Брэдли Р.А., Хантер Дж.С., Кендалл Д.Г., Миллер Р.Г.-младший и др., редакторы. Нью-Йорк: Wiley..
39. 39. Вилкинд С., Галлахер-Гамбарелли М., Гомес М., Хинтон Х.Дж., Кантрелл Д.А. (2005) Регуляция интегрина с помощью RhoA в тимоцитах. Дж. Иммунол 175: 350–357.
40. 40. Salmon WC, Adams MC, Waterman-Storer CM (2002)Двухволновая флуоресцентная спекл-микроскопия выявляет связь движений микротрубочек и актина в мигрирующих клетках.J Cell Biol 158: 31–37.
41. 41. Лауффенбургер Д.А., Хорвиц А.Ф. (1996) Миграция клеток: физически интегрированный молекулярный процесс. Ячейка 84: 359–369.
42. 42. Родригес О.К., Шефер А.В., Мандато К.А., Форшер П., Бемент В.М. и др. (2003)Консервативные взаимодействия микротрубочек и актина в клеточном движении и морфогенезе. Nat Cell Biol 5: 599–609.
43. 43. Hall A (2005) Rho GTPases и контроль поведения клеток. Biochem Soc Trans 33: 891–895.

Ускоренная микроскопия FRET-PAINT | Молекулярный мозг

Ускоренная диссоциация донорных нитей

Схема эксперимента FRET-PAINT и аппаратуры кратко представлены на рис. 1а. В предыдущей работе мы использовали EMCCD (iXon Ultra DU-897 U-CS0-#BV, Андор) с максимальной частотой кадров 56 Гц и площадью изображения 512 × 512. Однако из-за медленной диссоциации ДНК-зондов фактическая частота кадров составляла 10 Гц. В этой работе мы заменили EMCCD на sCMOS-камеру (ORCA-Flash 4.0 V2, Хамамацу) с максимальной частотой кадров 400 Гц для того же размера области изображения. Однако из-за фотоиндуцированного повреждения ДНК-зондов, которое будет объяснено позже более подробно, максимальная используемая частота кадров составляла 200 Гц. Чтобы компенсировать короткое время экспозиции, интенсивность освещения следует увеличивать пропорционально частоте кадров. По той же причине фотоиндуцированного повреждения ДНК мы использовали мощность освещения 1,5 кВт/см 90 118 2 90 119 , всего в 3,3 раза больше, чем 460 Вт/см 90 118 2 90 119 , которые использовались в предыдущей работе.

| Ускоренная диссоциация донорных нитей. ( a ) Схема микроскопии FRET-PAINT. Акцептор флуоресцирует только через FRET, и его сигнал регистрируется высокоскоростной sCMOS-камерой. Сигнал донора подавляется полосовым фильтром. ( b ) Цепи ДНК, используемые для экспериментов: стыковочные (черные), донорные (синие) и акцепторные (красные) нити. Длину донорной нити контролировали путем укорочения 5′-конца донорной нити. Акцепторные и донорные флуорофоры помечены в обозначенных позициях.( c-f ) Время диссоциации донорных цепей длиной 9 нт ( c ), 8 нт ( d ), 7 нт ( e ) и 6 нт ( f ). На левых панелях показаны репрезентативные временные трассы FRET, в которых высокие и низкие состояния FRET соответствуют связанным и несвязанным состояниям соответственно. Правые панели показывают гистограммы времени диссоциации. Времена диссоциации были получены путем подбора гистограмм экспоненциальной функцией затухания: 670 мс (9 нт), 63 мс (8 нт), 4,8 мс (7 нт) и 3.7 мс (6 nt)

Чтобы полностью использовать увеличенную частоту кадров sCMOS-камеры, скорость переключения ДНК-зондов также должна быть увеличена; если диссоциация ДНК-зонда идет медленно, пятна одиночных молекул начинают перекрываться при более низких концентрациях зонда, что ограничивает общую скорость визуализации. Определены времена диссоциации донорных нитей различной длины. Были протестированы четыре разные донорные нити (рис. 1b, синий). На рис. 1c–f показаны репрезентативные временные кривые (слева) и гистограммы времени диссоциации донорных нитей (справа).Полученные времена диссоциации составили 670 мс (9 нт), 63 мс (8 нт), 4,8 мс (7 нт) и 3,7 мс (6 нт). Было измерено, что время диссоциации 7- и 6-нуклеотидных донорных нитей короче, чем время экспозиции камеры (5 мс), и его следует считать неточным. Мы выбрали донорные нити из 7 нт для используемой в данной работе частоты кадров 100 или 200 Гц. Ауэр и др. ранее использовали донорные нити из 7 нт [11], но время диссоциации нити было намного больше (88 мс), чем у нас (4,8 мс).

Улучшенное отношение сигнал/шум (SNR)

Фоновый шум от плавающих донорных и акцепторных нитей ограничивает максимальную концентрацию зонда, которую можно использовать.Чтобы уменьшить фоновый шум и, как следствие, увеличить максимальные концентрации зонда для обеспечения разумного отношения сигнал-шум (SNR), мы сначала попробовали разные пары донор-акцептор, отличные от Alexa Fluor 488 (AF488, Invitrogen)-Cy5. (GE Healthcare), использованная в предыдущей работе. С точки зрения фонового шума, чем больше спектральное разделение излучения донора и акцептора, тем лучше SNR. Сопоставлены спектры поглощения и возбуждения красителей Alexa [12], красителей Atto [13, 14], красителей CF [15] и красителей Cy [12]. AF488 и Cy5 соответственно.На рисунке 2а сравниваются спектры возбуждения (пунктирные линии) и эмиссии (сплошные линии) AF488 (черный), CF488A (красный), Cy5 (пурпурный) и CF660R (фиолетовый). Спектры поглощения и испускания CF488A смещены в синюю сторону по сравнению со спектрами AF488, тогда как их коэффициенты экстинкции на пиках одинаковы. С другой стороны, спектр излучения CF660R сдвинут в красную сторону по сравнению с Cy5. В качестве дополнительной меры по улучшению отношения сигнал-шум мы также заменили длиннополосный фильтр 640 нм (зеленая пунктирная линия) полосовым фильтром 700/75 (зеленая сплошная линия).Поскольку у полосового фильтра длина волны отсечки смещена в красную сторону, чем у фильтра длинного пропускания, некоторая часть акцепторного сигнала теряется при замене, но мы ожидали, что уменьшение просачивания донора повысит отношение сигнал/шум на длинной донорной цепи. концентрации. Как и ожидалось, исходя из того, что CF488A имеет больший коэффициент экстинкции, чем AF488, при 473 нм, пара CF488A-Cy5 дала больше фотонов, чем пара AF488-Cy5 при той же мощности возбуждения (рис. 2б). Фоновый шум и, следовательно, отношение сигнал/шум были значительно улучшены за счет использования полосового фильтра вместо длиннополосного.И фоновый шум, и отношение сигнал/шум также были улучшены с парой CF488A-Cy5, чем с парой AF488-Cy5 (рис. 2c, d). Примечательно, что упомянутый выше процесс оптимизации почти полностью устранил просачивание доноров, в результате чего зависимость ОСШ от концентрации доноров была очень слабой (рис. 2г). Вопреки нашим ожиданиям, мы обнаружили, что замена Cy5 на CF660R не улучшила SNR, поскольку CF660R имеет более высокое прямое возбуждение, чем Cy5, на длине волны 473 нм (дополнительный файл 1: рисунок S1).Поскольку CF660R имеет более низкое прямое возбуждение, чем Cy5, при 488 нм, мы ожидаем, что CF660R может обеспечить лучшую производительность, если мы будем использовать лазер возбуждения 488 нм вместо лазера 473 нм в будущей работе. В этой работе мы использовали исключительно пару CF488A-Cy5 при возбуждении 473 нм.

| Улучшенное отношение сигнал/шум (SNR). ( a ) Спектры возбуждения (штриховые линии) и испускания (сплошные линии) донорных (AF488, черный; CF488A, красный) и акцепторных (Cy5, пурпурный; CF660R, фиолетовый) флуорофоров.Вертикальная синяя пунктирная линия указывает длину волны возбуждения 473 нм, вертикальная зеленая пунктирная линия указывает длину волны отсечки длиннополосного фильтра 640 нм, а зеленая сплошная линия указывает кривую пропускания полосового фильтра 700/75 мкм. ( b ) Сигнал акцептора пар AF488-Cy5 (черный) и CF488A-Cy5 (красный) при мощности возбуждения 1,5 кВт/см ² , зарегистрированный с помощью sCMOS-камеры и полосового фильтра. Сигнал акцептора пары AF488-Cy5 (синий) при мощности возбуждения 460 Вт/см ² , зарегистрированный камерой EMCCD и длиннополосным фильтром.Сигнал определяется как амплитуда двумерной гауссовой функции каждого пятна одной молекулы. Открытые квадраты обозначают измеренные значения, а сплошные линии обозначают аппроксимированные кривые с функцией Гаусса. Пара CF488A-Cy5 дает более высокую интенсивность. ( c ) Фоновый шум пар AF488-Cy5 (черный) и CF488A-Cy5 (красный) при мощности возбуждения 1,5 кВт/см ² с камерой sCMOS и полосовым фильтром. Фоновый шум пары AF488-Cy5 (синий) при мощности возбуждения 460 Вт/см ² с камерой EMCCD и длиннополосным фильтром.Фоновый шум определяется как полуширина гауссовой функции фонового сигнала. Незаштрихованные квадраты обозначают измеренные значения, а сплошные линии обозначают аппроксимированные кривые с квадратным корнем из концентрации донорных нитей. Полосовой фильтр значительно снижает фоновый шум, а пара CF488A-Cy5 дает более низкий фоновый шум, чем пара AF488-Cy5. Горизонтальная зеленая пунктирная линия указывает на фоновый шум без донорных и акцепторных нитей, который в основном вызван аутофлуоресценцией, исходящей от покровного стекла.( d ) Отношение сигнал/шум пар AF488-Cy5 (черный) и CF488A-Cy5 (красный) при 1,5 кВт/см пара (синяя) при 460 Вт/см ² мощность возбуждения, зарегистрированная с помощью камеры EMCCD и длиннополосного фильтра. SNR определяется как отношение сигнала к фоновому шуму. Незакрашенные квадраты обозначают расчетные значения, а сплошные линии обозначают аппроксимированные кривые с функцией обратного квадратного корня от концентрации донорной нити.Пара CF488A-Cy5 с sCMOS-камерой и полосовым фильтром обеспечивает самое высокое отношение сигнал/шум при высокой концентрации донорных нитей

Характеристика скорости формирования изображения нового микроскопа

скорость изображения нового микроскопа FRET-PAINT по сравнению с предыдущим. В качестве модельной системы визуализировали микротрубочки клеток COS-7. Для нового микроскопа использовались донорные нити длиной 7 нт и мощность возбуждения 1,5 кВт/см ² , тогда как для старого микроскопа использовались донорные нити 9 нт и мощность возбуждения 460 Вт/см ² .На рисунке 3а показано изображение со сверхвысоким разрешением, полученное с помощью старого микроскопа с частотой кадров 10 Гц и временем сбора данных 1 минута. Для визуализации использовали 30 нМ меченных AF488 донорных нитей и 20 нМ меченных Cy5 акцепторных нитей. На рис. 3b и c показаны изображения сверхвысокого разрешения, полученные с помощью нового микроскопа с частотой кадров 100 Гц для рис. 3b или 200 Гц для рис. 3c. Для визуализации общее время сбора данных составляло 1 мин, и использовались 300 нМ CF488A-меченые донорные нити и 300 нМ Cy5-меченые акцепторные нити.Как видно из рисунков, новый микроскоп позволял получать изображения более высокого качества, чем предыдущая установка FRET-PAINT, за более короткое время. Ширина поперечного сечения микротрубочек была аналогична ранее сообщаемому значению (дополнительный файл 1: рисунок S2) [11]. Чтобы более подробно показать улучшенное качество изображения, на рис. 3d-f также показаны цейтраферные изображения выделенных рамкой областей рис. 3a-c соответственно. Чтобы количественно сравнить качество изображения на рис. 3a-c, мы сравнили разрешение изображения в зависимости от времени получения изображения (рис. 3г). Разрешения получены методом кольцевой корреляции Фурье [16, 17]. Заметно, что разрешение достигло предела (42 нм для 100 Гц, 46 нм для 200 Гц) через 20–30 с с новой настройкой FRET-PAINT, тогда как разрешение все равно снижается даже через 60 с с предыдущей FRET-PAINT настраивать. В принципе, разрешение, определяемое методом кольцевой корреляции Фурье, зависит как от точности локализации, так и от плотности локализации [16,17,18,19]. Плотность локализации линейно пропорциональна времени визуализации (рис.3h), тогда как точность локализации не зависит от времени. Таким образом, можно сделать вывод, что для десятков секунд времени съемки разрешение изображения определяется точностью локализации в новом микроскопе. С другой стороны, для того же времени получения изображения разрешение изображения определяется плотностью локализации в старом микроскопе. Плотность локализации как функция времени визуализации на рис. 3h дает еще один способ сравнить скорость визуализации микроскопов. Скорость локализации увеличена на 5. 4 раза для изображения с частотой 100 Гц и 8 раз для изображения с частотой 200 Гц.

| Характеристика скорости изображения нового микроскопа. В качестве модельной системы использовали изображения микротрубочек сверхвысокого разрешения фиксированных клеток COS-7. ( a ) Изображение реконструировано из 600 кадров, записанных с частотой кадров 10 Гц с помощью предыдущего микроскопа (камера EMCCD, длиннополосный фильтр, 460 Вт/см ² мощность возбуждения, 30 нМ 9 нт AF488 донорные нити, 20 нМ 10 нт акцепторных цепей Cy5).( b , c ) Изображения были реконструированы из 6000 кадров, записанных с частотой кадров 100 Гц ( b ) или 12 000 кадров, записанных с частотой кадров 200 Гц ( c ) с помощью нового микроскопа ( sCMOS-камера, полосовой фильтр, мощность возбуждения 460 Вт/см ² , 300 нМ 7 nt CF488A донорные нити, 300 нМ 9 nt Cy5 акцепторные нити). Буфер для визуализации (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 500 мМ NaCl, 1 мг/мл глюкозооксидазы, 5 мг/мл глюкозы, 0,04 мг/мл каталазы и 1 мМ Trolox) использовался для всех изображений. Все изображения были реконструированы с помощью ThunderSTORM [23] с методом максимального правдоподобия. Общее время визуализации составляет 60 с для всех изображений. ( d — f ) Покадровые изображения выделенных областей в a — c в указанное время визуализации. ( g ) Разрешение изображения a — c с использованием метода кольцевой корреляции Фурье в зависимости от времени формирования изображения. Незакрашенные квадраты обозначают измеренное значение, а сплошные линии обозначают аппроксимированные кривые с экспоненциальной функцией затухания.( ч ) Плотность локализации как функция времени изображения (100 Гц, черный; 200 Гц, красный; 10 Гц, синий). Плотность локализации определяется как количество событий локализации на 1 мкм ² . Чтобы свести к минимуму влияние области интереса, выбранной для анализа данных, плотность локализации была рассчитана для 10 различных областей 5 разных клеток. Квадраты указывают среднее значение, а планки погрешностей указывают стандартное отклонение.