Лада каталог: Семейство Vesta — Официальный сайт LADA

Пожалуйста, введите действительное количество

Пожалуйста, авторизуйтесь, чтобы добавить в избранное.

НУЛЕВАЯ ИЛИ ПУСТАЯ КОРЗИНА

Обратите внимание, что контрольные лизаты НЕ входят в наборы. Контрольные лизаты продаются отдельно, каталожный номер TRF4008S.

Форматы:

• Наш набор на 500 точек анализа позволяет обрабатывать 500 лунок в формате 384 лунок, используя реакционный объем 20 мкл.
• Наш набор на 10 000 точек анализа позволяет обрабатывать 10 000 лунок в формате 384 лунок, используя реакционный объем 20 мкл.

LANCE ^® и LANCE ^® (возбуждает хелатный лантаноид) Ultra представляют собой гомогенные (без промывки) технологии TR-FRET (временное разрешение резонансного переноса энергии флуоресценции). Одно представляющее интерес антитело метят донорным флуорофором (хелат LANCE Europium), а второе антитело метят акцепторным флуорофором [краситель U Light ™]. При возбуждении на длине волны 320 или 340 нм энергия может передаваться от донорного хелата европия к акцепторному флуорофору, если он достаточно близок для FRET (~ 10 нм).Это приводит к испусканию света с длиной волны 665 нм. Данные представлены в логометрическом формате (665/615 нм X 10 000).

Эукариотический фактор инициации 2 (eIF2) представляет собой гетеротример, который участвует в инициации трансляции у эукариот. EIF2 связывается с двумя другими партнерами, GTP и Met-tRNAi, и образует преинициативный комплекс 43S при связывании субъединицы 40S. В условиях клеточного стресса альфа-субъединица может фосфорилироваться по S51 для подавления трансляции белка.

Характеристики

Краткое описание приложения

Введение иммуноферментных анализов (ELISA) в начале 1970-х годов дало исследователям платформу для нерадиометрических иммуноанализов без снижения чувствительности. За последние 50 лет ученые добились огромных успехов в исследованиях болезней и открытии лекарств, и возникла потребность в увеличении пропускной способности и чувствительности анализа. В ответ на это были разработаны более надежные иммуноанализы для устранения некоторых ограничений стандартного колориметрического ELISA.

Узнайте о наиболее распространенных ограничениях традиционных ИФА и о том, как различные альтернативные технологии ИФА устраняют эти ограничения.

PDF 1 МБ

Цифры и данные в датчике FRET C-концевого движения показывают активацию VRAC сигналом DAG плазматической мембраны, а не ионной силой

Клеточная линия ( Homo sapiens )	HeLa	RRID: CVCL_0030	ACC no.57	Получено из Leibniz Forschungsinstitut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Германия)
Клеточная линия ( Homo sapiens )	HEK293	RID:	. 305	Получено из LeibnizForschungsinstitut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Германия)
Клеточная линия ( Homo sapiens )	HEK293 KRC20 — L, 2017 (PMID: 28193731)		Подарок от T.J. Jentsch (MDC and FMP, Берлин, Германия)
Трансфицированная конструкция	A-GFP (LRRC8A-GFP)	Voss et al., 2014 (PMID: 247 )		Подарок от T.J. Jentsch (MDC and FMP, Берлин, Германия)
Трансфицированная конструкция	A-CFP (LRRC8A-CFP)	Эта статья		LRRC8A-кодирующая последовательность, субклонированная из A-GFP (Voss et al., 2014)
Трансфицированная конструкция	A-CFP-FM 2 (LRRC8A-CFP-FM 2 )	Эта статья		2 домена FM (Rollins et al. , 2000) клонирован в LRRC8A-CFP с сайтами вставки, созданными Q5-мутагенезом
Трансфицированная конструкция	A N66A, N83A -CFP (LRRC8A N66A, N83A -CFP)	Эта статья -кодирующая последовательность, субклонированная из A N66A, N83A -GFP (Voss et al., 2014; подарок TJ Jentsch, MDC and FMP, Берлин, Германия)
Трансфицированная конструкция	A-CFP (LRRC8A-Cerulean)	В этой статье		LRRC8A-кодирующая последовательность, субклонированная из A-GFP (Voss et al., 2014)
Трансфицированная конструкция	A-YFP (LRRC8A-YFP)	Эта статья		LRRC8A-кодирующая последовательность, субклонированная из A-GFP (Voss et al., 2014)
Трансфицированная конструкция	E-CFP (LRRC8E-CFP)	Эта статья		LRRC8E-кодирующая последовательность, субклонированная из LRRC8E-GFP (Voss et al. , 2014; подарок TJ Jentsch, MDC и FMP, Берлин, Германия)
Трансфицированная конструкция	E-YFP (LRRC8E-YFP)	Эта статья		LRRC8E-кодирующая последовательность, субклонированная из LRRC8E-GFP (Voss et al., 2014)
Трансфицированная конструкция	E-YFP (LRRC8E-Venus)	Эта статья		LRRC8E-кодирующая последовательность, субклонированная из LRRC8E-GFP (Voss et al., 2014), трансфицированная
E-RFP (LRRC8E-RFP)	Эта статья		LRRC8E-кодирующая последовательность, субклонированная из LRRC8E-GFP (Voss et al., 2014)
Трансфицированная конструкция	CFP82-18AA3 и другие., 2009 (PMCID: PMC2706461)		Подарок от C. F. Камински (Кембриджский университет, Великобритания)
Трансфицированная конструкция	GluA2-6Y-10C	Zachariassen et al., 2016 (PMID: 27313205)
Трансфицированная конструкция сенсора RD	Liu et al., 2017 (PMID: 28853549)		Подарок от B. Poolman и AJ Boersma (Университет Гронингена, Нидерланды)
Трансфицированная конструкция	ER-YFP (pEYFP-ER)	Clontech, TaKaRa	Кат.6906–1
Трансфицированная конструкция	GalNAc-T2-RFP	Эта статья		Кодирующая последовательность стебельчатой ​​области GalNAc-T2, субклонированной из GalNAc-T2-GFP (Le Bot et al. , 1998; подарок; от I. Vernos, CRG, Барселона, Испания)
Трансфицированная конструкция	CD4-YFP	Эта статья		hCD4-кодирующая последовательность, субклонированная из CD4-GFP (Leisle et al., 2011; PMID: 21527911)
Химическое соединение, лекарственное средство	Брефельдин-А; BFA	Sigma-Aldrich	Кат.B5936	Готовый раствор 10 мг / мл в растворе на основе ДМСО, использованный при конечной концентрации 5 мкг / мл
Химическое соединение, лекарство	Д / Д солюбилизатор	Clontech, TaKaRa	Кат. . 635054	Получен в виде раствора, использованного при конечной концентрации 0,5 мкМ в питательной среде
Химическое соединение, лекарственное средство	Латрункулин B; LatB	Sigma-Aldrich	Кат. 428020	Исходная смесь, приготовленная в ДМСО, использованная при конечной концентрации 2 мкМ
Химическое соединение, лекарство	Alexa Fluor 546-фаллоидин	Thermo Fisher Scientific	Кат.A22283	Разбавленный 1: 1000 в PBS + 1% BSA
Химическое соединение, лекарственное средство	Метил-β-циклодекстрин; MbCD	Sigma-Aldrich	Кат. C4555	Растворяют в DMEM и стерилизуют фильтрованием перед использованием, используют при конечной концентрации 5 мМ
Химическое соединение, лекарство	Филиппинский	Sigma-Aldrich	Кат. SAE0088	Готовый раствор комплекса филиппина 5 мг / мл в растворе на основе ДМСО, использованный при конечной концентрации 125 мкг / мл в PBS
Химическое соединение, лекарственное средство	Форбол-12-миристат-13-ацетат ; PMA	Tocris, Bio-Techne	Кат. 1201/1	Исходная смесь, приготовленная в ДМСО, использованная в конечной концентрации 1 мкМ
Химическое соединение, лекарство	Gö6983	Abcam	Кат. ab144414	Исходная смесь, приготовленная в ДМСО, использованная в конечной концентрации 1 мкМ
Химическое соединение, лекарство	CRT 0066101	Tocris, Bio-Techne	Кат. 4975/10	Исходная смесь, приготовленная в H 2 O, использованная при конечной концентрации 5 мкМ
Химическое соединение, лекарственное средство	Диоктаноилгликоль; DOG	Tocris, Bio-Techne	Кат.0484	Исходный материал, приготовленный в ДМСО, использованный при конечной концентрации 100 мкМ
Программное обеспечение, алгоритм	Fiji	Schindelin et al. , 2012 (PMID: 22743772)
Программное обеспечение, алгоритм	Feige et al., 2005 (PMID: 16208719)
Программное обеспечение, алгоритм	µManager	Edelstein et al., 2014 (PMID: 25606571)
https: // pythonhosted.org / pyserial / index.html

Внутримолекулярные биосенсоры FRET

Мониторы фосфорилирования и гуанин-нуклеотидного обмена

Версия 9.0 выпущена 21 октября 2020 г.

Лаборатория биоимиджинга и клеточной сигнализации, Высшая школа биологических исследований; Кафедра патологии и биологии болезней Высшей школы медицины Киотского университета

Для переписки: Мики Мацуда; Электронная почта: мацуда. michiyuki.2c (атто) kyoto-u.ac.jp

Запись модификаций

1. 24.01.2021 Изображения SWF заменены анимационными файлами GIF.
2. 24.05.2019 Обновлен каталог мыши FRET.
3. 03.04.2019 Обновлен каталог внутримолекулярных биосенсоров FRET.
4. 25.12.2018 Добавлена ​​мышь FRET в Kyoto Univ и обновлен каталог внутримолекулярных биосенсоров FRET.
5. 13.12.2011 Техническое описание Phogemon загружено.

Конечно, мы знаем (хотя иногда делаем вид, что не знаем), что клетки на пластиковой посуде полностью отличаются от клеток живых организмов. Однако в эпоху биохимии и молекулярной биологии нам требовалась масса однородных клеток для детального анализа интересующей молекулы, и нам приходилось использовать клетки на чашках. Лизис клеток, который является первым шагом большинства биохимических и молекулярно-биологических методов, неизбежно отбрасывает пространственно-временную информацию об интересующей молекуле.Чтобы решить эту проблему, мы начали разрабатывать методы мониторинга активности сигнальных молекул. Помня об этом, в 1998 году мы начали разработку мониторов для пространственно-временной информации о внутриклеточной передаче сигналов. Поскольку нашей непосредственной целью была разработка мониторов для киназ и G-белков, двух ключевых участников передачи сигналов, мы назвали этот проект «Проект мониторинга фосфорилирования и гуанин-нуклеотидного обмена» (проект PHOGEMON). В 2001 году мы сообщили о трех мониторах для Ras, Rap1 и CrkII и начали распространение этих PHOGEMON.Поскольку существует множество технических препятствий, с которыми пользователи PHOGEMON столкнутся при попытке визуализировать внутриклеточные сигнальные события, а также поскольку датчики и методы постоянно совершенствуются, мы представляем наше руководство в Интернете и будем продолжать его обновлять. Мы надеемся, что наш PHOGEMON привлечет многих ученых, желающих увидеть живые изображения сотовой передачи сигналов.

3.1 Что такое FRET?

FRET, резонансный перенос энергии Фёрстера (или флуоресценции), представляет собой процесс, посредством которого происходит безызлучательный перенос энергии от флуорофора донора к молекуле акцептора в непосредственной близости [1]. Этот процесс обычно сопровождается флуоресценцией молекулы акцептора. В нашем проекте мы обычно используем пару мутантов зеленого флуоресцентного белка (GFP) [2]. Мы предпочитаем использовать мутант GFP, излучающий голубой (CFP), и мутант GFP, излучающий желтый цвет (YFP). На рис. 3101 показана схема FRET между CFP и YFP. Возбужденный CFP обычно излучает голубую флуоресценцию (левая панель). Если YFP расположен близко к CFP, возникает FRET и наблюдается флуоресценция YFP (правая панель). Следует помнить, что в случае Gflourescent белков донор и акцептор должны располагаться на расстоянии не более 5 нм друг от друга, чтобы FRET можно было обнаружить.Поскольку около 20 кДа глобулярные белки имеют диаметр 5 нм, присутствие FRET почти идентично прямому контакту между CFP и YFP.

3.2 Межмолекулярные и внутримолекулярные биосенсоры FRET

FRET можно применять для обнаружения белок-белкового взаимодействия внутриклеточных сигнальных молекул.Фиг. 3201 иллюстрирует пример, в котором зеленый белок связывается с коричневым белком и отделяется от него. После того, как зеленый белок помечен CFP, а коричневый — YFP, мы можем контролировать образование комплекса путем количественной оценки эффективности FRET, которую можно рассчитать путем измерения интенсивности флуоресценции YFP и CFP. Этот межмолекулярный датчик FRET имеет некоторые недостатки в применении для визуализации in vivo. Во-первых, трудно ввести равные количества слитых белков YFP и CFP в одну клетку.Во-вторых, гибридный белок YFP и гибридный белок CFP обычно имеют различное субклеточное распределение. Неравномерность слитых белков YFP и CFP заставляет исследователей корректировать свойства фильтров, оснащенных флуоресцентным микроскопом. В-третьих, экспрессия сигнальных молекул в большей или меньшей степени конкурирует с аутентичными каскадами передачи сигнала.

Чтобы преодолеть недостатки межмолекулярной системы FRET, два белка могут быть объединены для создания внутримолекулярного зонда FRET, как показано на фиг. 3202.Этот подход также полезен для обнаружения конформационных изменений в отдельном белке. Однако самым большим недостатком этой внутримолекулярной системы FRET является сложность позиционирования флуорофора и белков таким образом, чтобы внешние стимулы изменяли эффективность FRET. Более простой вариант внутримолекулярного зонда FRET показан на фиг. 3203. В этом типе зонда только один белок из связывающих пар слит с YFP и CFP. Связывание слитого белка с другим белком-партнером диссоциирует YFP и CFP, снижая эффективность FRET.Этот метод превосходит то, что нам нужно выразить только одну из пар связывания. Возможный дефект состоит в том, что вызванное ассоциацией изменение эффективности FRET может быть недостаточно большим для визуализации клеточной передачи сигналов.

4.1 Базовая структура

PHOGEMON — это название внутримолекулярных FRET-зондов (далее называемых биосенсорами FRET, которые становятся все более популярными в обществе), разработанных в нашей лаборатории. Базовая структура PHOGEMON, или биосенсора FRET, повторяет структуру камелеона, разработанную Ацуши Мияваки и Роджером Циеном [6]. Cameleon состоит из кальций-связывающего домена кальмодулина и кальмодулин-связывающего домена белка M13, расположенных между YFP и CFP.Точно так же биосенсор FRET состоит из YFP, области сенсора, области лиганда и CFP. Каждый домен соединен спейсерами (рис. 4103). При стимуляции конформация сенсорной области изменяется так, что она связывается с лигандной областью. Возможные пары сенсорных и лигандных доменов включают «G-белок по сравнению с молекулой-мишенью», «сайты фосфорилирования тирозина по сравнению с доменами Sh3» и «сайты фосфорилирования треонина по сравнению с доменами WW».

Эффективность FRET биосенсора FRET зависит в первую очередь от расстояния и относительной ориентации донора и акцептора.Мы называем эти два типа биосенсора FRET «зависимыми от ориентации и» зависимыми от расстояния «биосенсорами FRET соответственно (рис. 4105). Хотя биосенсор FRET, зависящий от ориентации, может обладать более высокой чувствительностью, чем биосенсор FRET, зависящий от расстояния, мы вряд ли могли предсказать и контролировать ориентацию донора и акцептора для разработки оптимального биосенсора FRET. Это связано с тем, что мы обычно не знаем трехмерных структур биосенсора, с которым связан сенсорный домен (gONh) и не связан (gOFFh) с лигандным доменом.

Усиление и динамический диапазон: Перед оценкой биосенсоров FRET, описанных в этом исследовании, мы определим технические термины, относящиеся к их характеристикам. FRET определяется с помощью логометрии: клетки возбуждаются на длине волны 440 нм, и отношение интенсивности флуоресценции канала YFP (FRET) к интенсивности флуоресценции канала CFP (CFP), FRET / CFP, используется для представления уровня состояния FRET-on.Здесь gdynamic rangeh биосенсора FRET представляет собой теоретический диапазон FRET / CFP в состоянии биосенсора gONh и в состоянии gOFFh (рис. 4104).

При практическом использовании изменение активности или концентрации молекулы отслеживают по изменению FRET / CFP после стимуляции. Это усиление сигнала FRET представляет собой относительное увеличение или уменьшение FRET / CFP после стимуляции и выражается в процентах от значения FRET / CFP до стимуляции.Следовательно, усиление биосенсора FRET, экспрессируемое в определенном типе клеток, зависит как от динамического диапазона биосенсора FRET, так и от увеличения доли состояния gONh после стимуляции по сравнению с таковой до стимуляции. Между тем, gsensitivityh биосенсоров FRET обозначает концентрацию стимуляторов, которая увеличивает значение FRET / CFP до 50% от gdynamic диапазона «. Для подробного анализа, пожалуйста, обратитесь к нашей недавней статье [31].

4.2 Флуоресцентные белки

В настоящее время большинство генетически кодируемых зондов FRET используют CFP и YFP в качестве донора и акцептора, соответственно.Мы пробовали несколько комбинаций донорных и акцепторных флуоресцентных белков. флуоресцентные белки. В качестве донорных флуоресцентных белков мы тестировали флуоресцентный белок чирка (TFP), флуоресцентный белок, полученный из кораля, и флуоресцентные белки, производные от CFP, включая ECFP, бирюзу и CyPet, а в качестве акцепторных флуоресцентных белков мы исследовали флуоресцентные белки, производные YFP. включая Венеру, мутанты Венеры с круговой перестановкой, mCitrine и YPet. Среди них биосенсоры FRET, содержащие бирюзу / YPet, показали наибольший прирост FRET / CFP.Примечательно, что YPet не показал никакого превосходства над Венерой, когда TFP использовался в качестве донора (Фиг.4106), предполагая, что пара склонных к димеризации флуоресцентных белков подходит для дистанционно-зависимого биосенсора FRET. Круглые перестановки могут значительно улучшить эффективность FRET / CFP. Однако механизм действия может не заключаться в изменении ориентации флуорофора, как предполагалось изначально. Последние данные предполагают, что конформационное изменение мутантов cp посредством взаимодействия может изменять соотношение FRET / CFP.Взятые вместе, эти результаты привели нас к выводу, что пара Turquoise-GL / YPet была подходящей для пары донора и акцептора зависимого от расстояния внутримолекулярного биосенсора FRET. Пара GFP и RFP используется в некоторых исследованиях, особенно в микроскопии с двухфотонным возбуждением. Однако в наших руках мы еще не обнаружили превосходства пары GFP-RFP над парой CFP-YFP. Недавно мы обнаружили, что белки Kusabira orange и mKate эффективно работают как пара FRET в длинноволновой области (doi: 10.1021 / acssensors.9b01941).

4.3 Сенсорные и лигандные домены

Примеры пар сенсорных и лигандных доменов показаны на фиг. 4107. Кристаллографические данные о белках сенсора и лиганда помогут нам определить минимальную область, которая должна быть включена в биосенсор FRET.Однако мы должны подчеркнуть, что даже с такими данными о белковом комплексе мы не смогли вывести какой-либо принцип оптимальной конструкции биосенсора FRET до сих пор. Порядок YFP, сенсора, лиганда и CFP можно изменить. На аминоконце может быть размещен либо сенсорный, либо лигандный участок, только если ассоциация между сенсорным и лигандным участками изменяет эффективность FRET. Хан и его коллеги разработали биосенсор Rho, в котором CFP и YFP тандемно связаны и далее зажаты между RhoA и его эффекторным белком.Поскольку CFP и YFP устанавливаются в непосредственной близости, базальный уровень FRET обычно довольно высок в этой конструкции зонда.

4.4 Проставки

Ранее мы показали, что базальное соотношение GTP / GDP биосенсора Ras FRET было заметно больше, чем у эндогенного белка Ras, что подразумевает, что близкое расположение сенсорных и лигандных доменов может увеличивать долю биосенсоров FRET во включенном состоянии [ 4].Вероятно, это связано с тем, что домен лиганда конкурентно ингибирует доступ GAP к биосенсору. Это наблюдение побудило нас удлинить линкер, чтобы уменьшить долю биосенсоров FRET в состоянии ВКЛ. Мы приготовили (SAGG) n линкеров (n = от 13 до 61) и вставили их в прототип биосенсора PKA. Как и ожидалось, FRET / CFP в отсутствие стимуляции обратно коррелировал с длиной линкера (Фиг.4108). Усиление биосенсоров FRET при стимуляции dbcAMP коррелировало с длиной линкера, обусловленным снижением FRET / CFP в отсутствие dbcAMP.На основе этих данных мы предложили оптимизированную основу биосенсоров FRET, которая состоит из пары FRET, подверженной димеризации, такой как YPet и CyPet, и длинного гибкого линкера, названного линкером EV.

4.5 Сигналы локализации

Чрезвычайно важно разместить биосенсор FRET в правильной внутриклеточной локализации.Самым большим недостатком биосенсора FRET является его низкое отношение сигнал / шум (S / N). Это можно объяснить в основном природой системы FRET CFP-YFP, в которой выбросы CFP перекрываются с выбросами YFP. Таким образом, даже без FRET (рис. 4501) в канале YFP ​​присутствует значительный объем сквозного сигнала. Следовательно, избыток биосенсора значительно увеличивает фоновый сигнал в канале YFP ​​и тем самым снижает отношение сигнал / шум, поскольку уровень шума коррелирует с количеством зонда.

Есть два возможных способа преодолеть этот недостаток. Первый метод — использование конфокального микроскопа, который может исключить сигнал флуоресценции из несфокусированных областей. Однако, как мы обсудим в другом месте, использование конфокальных сканирующих лазерных микроскопов не рекомендуется в большинстве интервальных экспериментов FRET. Второй метод — удаление биосенсора из нерелевантных участков.Это причина того, что многие биосенсоры FRET нацелены на определенные субклеточные области.

4.6 Экспрессионные плазмиды и клетки для характеристики

Плазмиды: Вторым по величине дефектом современных биосенсоров FRET было отсутствие стабильных клеточных линий и трансгенных мышей. Мы обнаружили, что использование транспозазы для доставки кДНК биосенсора FRET почти полностью преодолело эти дефекты (фиг. 4110). Вероятно, подойдет любая из систем переноса генов, опосредованных транопозоном.Мы проверили, что piggyBac [33] и Tol2 [32] работают достаточно эффективно. Примечательно, что современные системы переноса генов, опосредованные трансопозазой, являются «обратимыми»; то есть интегрированный ген биосенсора может быть вырезан путем повторной экспрессии транспозазы. Имея две системы переноса генов, опосредованные транспозазой, мы можем стабильно экспрессировать по крайней мере два разных гена.

Обычно мы используем экспрессионную плазмиду, содержащую рекомбинационную последовательность piggyBac, для экспрессии биосенсора FRET в клетках культуры ткани.Плазмиды экспрессии, содержащие последовательность рекомбинации Tol2, используются в основном для создания трансгенных мышей.

Клетки: Мы обычно используем клетки 293F, которые растут либо в суспензии, либо в адгезии. После трансфекции экспрессионных плазмид эффективность FRET отслеживают с помощью FACS (FACS Aria, 408 нм). Путем совместной экспрессии активатора или инактиватора или предварительной инкубации со стимулятором или ингибитором можно легко и количественно измерить прирост биосенсора FRET.

4.7 Процедура разработки биосенсора FRET

Ниже приводится наша стандартная процедура разработки биосенсора FRET. Также ознакомьтесь с нашим опубликованным протоколом. [34]

1. Выберите сенсор и лигандные домены.
2. Используйте ПЦР для клонирования сенсорных и лигандных доменов с сайтами узнавания рестрикционных ферментов.
3. Вставьте эти фрагменты кДНК в базовую плазмиду FRET.
4. Трансфекция плазмиды в клетки 293F.Для оценки свойств зонда FRET мы совместно экспрессируем зонд с активатором (GEF или киназа) или инактиватором (GAP или фосфатаза). В качестве альтернативы мы можем ввести активную или неактивную мутацию в сенсорную область. В случае Ras мы вводим мутации G12V и S17N соответственно.
5. Проанализируйте спектр флуоресценции. См. Раздел 6.1 Флуоресцентный спектральный анализ.
6. Выполните пилотную визуализацию FRET в простых в обращении ячейках.
7. Применить к интересующим ячейкам.

4.8 Мыши FRET: трансгенные мыши, экспрессирующие биосенсор FRET

Трансопозон-опосредованный перенос гена может ускорять продукцию трансгенных мышей [35]. Более того, мы обнаружили, что опосредованный транспозоном перенос гена также может предотвращать рекомбинацию между CFP и YFP во время интеграции, обеспечивая эффективное производство трансгенных мышей, экспрессирующих биосенсор FRET, которых мы вместе называем мышами FRET [36].С промотором CAG мыши FRET обладают достаточной яркостью, чтобы при рождении их можно было обследовать в УФ-свете (рис. 4801, слева). Кожа уха наиболее удобна для наблюдения под микроскопами с двухфотонным возбуждением. Мы можем видеть все слои ткани уха мыши (рис. 4801, справа). Для прижизненной визуализации мыши вам следует обратиться к другим протоколам. Вкратце, мы помещаем под наркозом мышь под микроскоп и наблюдаем с помощью вертикального микроскопа с двухфотонным возбуждением (Olympus IX81-FV1000, Spectra Physics Mai-Tai DeepSee) (рис. 4802).

5.1 Зонды для малых GTPases

1. Райчу-Рас и Райчу-Рап1

«Райчу» — это аббревиатура от Ras и взаимодействующей химерной единицы белка. Райчу отслеживает активность белков G семейства Ras [4]. Для получения подробной информации щелкните здесь.

2. Райчу-Рала

Raichu-RalA — зонд, предназначенный для мониторинга активности RalA [30].Для получения подробной информации щелкните здесь.

3. Raichu-RRas

Raichu-RRas — зонд, предназначенный для мониторинга активности RRas в эндосомном компартменте; RRas отвечает за активацию RalA через Rgl2 / Rlf [25].

4. Raichu-Rac1, Raichu-Cdc42 и Raichu-CRIB-X

Вслед за Raichu-Ras и Raichu-Rap1 мы разработали Raichu-Rac1, Raichu-CRIB и Raichu-CRIB-X [18]. Для получения подробной информации щелкните здесь.

5. Райчу-РоА и Райчу-РБД

Raichu-RhoA — это зонд, предназначенный для мониторинга баланса активности между GEF и GAP. Raichu-RBD контролирует уровень эндогенного GTP-RhoA [20]. . Для получения подробной информации щелкните здесь.

6. Raichu-TC10

Raichu-TC10 — датчик, предназначенный для мониторинга активности TC10. TC10 активен в эндосомальных пузырьках и инактивируется непосредственно перед слиянием пузырьков на плазматической мембране [22].

7. Райчу-Раб5

Raichu-Rab5 — зонд, предназначенный для мониторинга Rab5 регуляции слияния везикул ранних эндосом и фагосом. [31].

5.2a Зонды, обнаруживающие конформационные изменения киназ

1. Пикчу

«Пикчу» означает фосфорилирование. индикатор химерного звена Crk [7]. Для получения подробной информации щелкните здесь.

2. Прин-Раф

«Прин», что расшифровывается как «Фотометрический» Индикатор Raf — это зонд, предназначенный для мониторинга конформационных изменений белков Raf, cRaf и BRaf [27, 28].Для получения подробной информации щелкните здесь.

3. Miu2

«Миу2», что расшифровывается как МАПК. Индикаторная единица ERK2, представляет собой зонд, предназначенный для мониторинга конформационных изменений киназы ERK2 MAP [29].

4. Акинд

«Акинд», что расшифровывается как Акт индикатор, представляет собой зонд, предназначенный для мониторинга конформационного изменения Akt [26].

5.2b Зонды, определяющие фосфорилирование субстрата

1. Зонды Eevee

Мы называем FRET биосенсоры, содержащие линкер EV, вместе как «Eevee», что означает расширение для улучшенной визуализации за счет уклонения от extra-FRET [31].При применении линкера EV чувствительность AKAR (датчик PKA), JNAKAR (датчик JNK), EKAR (датчик ERK) и т. Д. Была значительно увеличена. Кроме того, мы могли бы создать биосенсоры PKC, Akt, S6K и RSK с гораздо меньшими усилиями, чем ранее разработанный зонд.

5.3 Датчики липидов

1. Пеппи

«Pippi», что означает индикатор фосфатидилинозитолфосфата, очень похож на Fllip, монитор для PIP ₃ , который был элегантно разработан Умезавой и его коллегами [23].4 клетки HeLa на чашке со стеклянным дном диаметром 35 мм.

2. Трансфекция 1 мкг экспрессионной плазмиды для биосенсора FRET путем липофекции (например, 293 Fectin).
3. Наблюдайте за клетками с помощью конфокального микроскопа с режимом лямбда-сканирования. Мы используем Olympus FV1000.
4. Мы используем либо 440 нм He-Cd лазер, либо 435 нм полупроводниковый лазер для возбуждения CFP.
5. Получите спектр излучения в режиме ламда-сканирования.
6. Чтобы проверить, работает ли биосенсор FRET, вы можете выбрать любой из следующих методов.
   • Коэкспресс активатор / инактиватор интересующих молекул. В случае Ras мы используем GEF и GAP.
   • Добавьте ингибитор или активатор. При ERK мы используем ингибитор MEK и каликулеин (ингибитор фосфатазы).

6.2 Анализ спектра флуоресценции in vitro

Обычно возбуждение YFP ​​на длине волны 433 нм не мешает интерпретации результатов. Однако, когда уровень экспрессии CFP низкий, вы можете ошибочно принять сигнал от YFP, возбужденного на длине волны 433 нм, как признак FRET. Это легко исключить следующим способом.

1. Добавьте 100 мкг протеиназы К к клеточному лизату.Выдержать 10 мин при 37 ^o C.
2. Анализируйте с помощью флуоресцентного спектрометра.

Поскольку флуоресцентные белки исключительно устойчивы к протеиназам, если вы обработали рекомбинантные белки, слитые с GFP, протеиназами, он будет расщепляться только на участках за пределами Gflourescent белков. Таким образом, после PK-обработки биосенсора FRET вы получите бесплатные YFP ​​и CFP. Если флуоресценция YFP исчезает после обработки протеиназой К, это подтверждает присутствие FRET (фиг. 6101, желтая линия).

6.3 Визуальная спектрофлуориметрия

Мы больше не используем следующий метод, который был заменен методом 6-1.
В ходе разработки зонда мы иногда замечали несоответствие между эффективностью FRET, полученной из данных визуализации, и эффективностью FRET, анализируемой спектрометром in vitro, как описано выше. Помните, что мы определяем конформационные изменения зонда, измеряя эффективность FRET. Лизируя клетки, мы, вероятно, теряем белки, которые слабо взаимодействуют с зондом, что может повлиять на эффективность FRET в клетках, но не в лизате.Чтобы преодолеть эту ситуацию, мы можем использовать спектрофлуориметрию изображений, которая позволяет нам получить спектрограмму отдельной клетки. Клетки получали на инвертированном микроскопе, оснащенном спектрографом с плоским полем, SpectraPro 150 (Acton Research, Acton, MA), охлаждаемой CCD-камерой Spec-10: 256E и программным обеспечением inSpec32 (Roper Scientific, Трентон, Нью-Джерси). Определяют область на клетке, покрывающую всю или часть клетки, экспрессирующей зонд. Флуоресценция разделяется на радугу через решетчатое зеркало, и этот спектр флуоресценции регистрируется камерой CCD.

7.1 Темная комната

Полная темнота не требуется. Однако люминесцентная лампа на потолке усилит фон. Еще одна причина, по которой мы рекомендуем использовать темную комнату, заключается в том, что сохранение хорошей фокусировки в течение длительного времени имеет решающее значение для получения хороших видеоданных. Пока вы собираете данные, важно не позволять никому прикасаться к вашему микроскопу.

7.2 Флуоресцентный микроскоп

Мы используем инвертированные эпифлуоресцентные микроскопы Olympus IX81, оснащенные системой автофокусировки ZDC и XY моторным приводом. Эта система автофокусировки стала важным инструментом, потому что она позволяет нам следить за несколькими клетками во время обычных покадровых экспериментов. Например, если вы хотите следить за цитокинезом, делая снимки каждые 10 минут в течение 1 или 2 дней, вы можете легко проследить за десятками клеток, используя систему автофокусировки и мотор XY.

7.3 Источник света

В качестве источника света мы используем светодиод. Учитывая срок службы дуговых ламп, светодиоды более экономичны, чем ксеноновые или ртутные дуговые лампы.

7,4 DIC и PH

Для наблюдения за морфологией клеток необходимо применять фазовый контраст (PH) или дифференциальный интерференционный контраст (DIC). Обратите внимание, что вы потеряете некоторый процент флуоресценции из-за фазового кольца, оснащенного линзой объектива для PH. Когда вы используете систему DIC, поляризатор можно установить либо в устройстве смены колеса эмиттера, либо в кубе фильтра прямо под линзой объектива.Первое желательно, когда необходима быстрая смена фильтра, но это происходит за счет снижения качества изображения.

7.5 Камера

Мы использовали камеру, чтобы закрыть большую часть микроскопа. Однако после внедрения системы автофокусировки ZDC мы теперь используем небольшую камеру для большинства экспериментов. Для точного контроля температуры вам также может потребоваться t нагреватель линз.

7.6 ПЗС-камера

ПЗС-камера становится дешевле, но все же ПЗС-камера остается одной из самых дорогих частей системы визуализации данных. Чтение учебников по принципам работы ПЗС-камер сэкономит вам много денег, так как вы сможете избежать перерасхода средств на камеру, характеристики которой вам не нужны. Мы используем CoolSNAP HQ (Roper Scientific) более десяти лет для рутинной визуализации FRET. Камера CCD со встроенным усилителем полезна для TIRF и т. Д.Однако для большинства рутинных экспериментов такая высокочувствительная камера является избыточной, поскольку автофлуоресценция клеток является ограничивающим фактором отношения сигнал / шум FRET-изображения. Недавно мы заменили некоторые HQ на K4, который имеет более широкий ПЗС-чип и позволяет отображать все поле обзора. / P>

7.7 Комплект фильтров

Мы используем 440AF21 (XF1071) для возбуждения, 455DRLP (Omega Optical., Brattleboro, VT) для дихроичного зеркала, 480AF30 (XF3075) для CFP и 535AF26 (XF3079) для YFP. Фильтр нейтральной плотности 6–12% обычно используется для предотвращения фотообесцвечивания.

7,8 Анализ

Мы используем MetaMorph (Universal Imaging; Саннивейл, Калифорния). Для получения изображений всем системам обработки изображений требуется программное обеспечение для обработки изображений. Кроме того, вам, вероятно, потребуется установить на ПК отдельное программное обеспечение. Ниже приводится краткая процедура анализа изображений FRET.

1. Сохраните изображения CFP и YFP как файлы стека.
2. Задайте регионы без ячеек в качестве эталонов и вычтите их среднюю интенсивность из файлов стека, чтобы подготовить файлы стека с вычитанием фона. Пожалуйста, прочтите файл макроса, который называется MetaMorph Journal.
3. Сделайте масштабное изображение YFP ​​/ CFP. Обычно соотношение устанавливается от 2 до 3. Как вариант, вы можете использовать автоматический журнал.

7.9 Технические советы

1. Начните с самого простого эксперимента. Мы рекомендуем начать с визуализации активации Ras в клетках COS, стимулированных EGF.
2. Вы скоро заметите индивидуальность каждой ячейки. Вы должны научиться находить ячейку, которая дает вам лучшее изображение. Клетки, экспрессирующие большее количество биосенсора FRET и не показывающие повреждений, станут хорошими кандидатами.
3. EGF вызовет взъерошивание мембраны. Если вы не можете найти рябь, значит, ваша клетка или EGF неправильные.Клетки необходимо содержать в хорошем состоянии.
4. Минимальное освещение. Всегда не забывайте устанавливать фильтр нейтральной плотности. YFP может привести к фотообесцвечиванию. Вы не обнаружите FRET, если потратите слишком много времени на поиски хорошей ячейки.
5. Изображение с соотношением сторон отображается в цветах от синего до красного. Поскольку изменение от синего к зеленому не очень заметно для наших глаз, мы предпочитаем устанавливать диапазон соотношения в основном от зеленого к красному.

7.10 Использование вирусных векторов

1. Аденовирус: для доставки генов Райчу и Пикчу в некоторые клеточные линии мы используем рекомбинантный аденовирус.Руководство доступно в Clontech.
2. Ретровирус: ретровирус нельзя использовать для доставки биосенсоров FRET, поскольку рекомбинация между CFP и YFP неизбежна.

8.1 Визуализация активности Ras с помощью Raichu-Ras

8.1.1 Культура

1. Покройте чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм коллагеном типа I.
2. Планшет с клетками COS1 до 50% слияния в DMEM-10% FBS.
3. Трансфицировать 2 микрограмма pRaichu-124X в клетки COS1 с помощью Polyfect (Qiagen, Hilden, Германия).
4. Через 6 часов замените среду на 2 мл MEM без фенолового красного (Nissui, Tokyo), содержащую 10% FBS.
5. На следующее утро удалите 1 мл супернатанта культуры и поместите в микропробирку.
6. Добавьте EGF в эту микропробирку в концентрации 50 нанограмм / мл.
7. Отнесите блюдо в комнату для микроскопов.

8.1.2 Наблюдение

1. Включите ксеноновую лампу, обогреватель и т. Д.
2. Поместите клетки на предметный столик микроскопа и накройте чашку камерой CO ₂ .
3. Подождите 1 час, чтобы клетки акклиматизировались в камере.
4. Запустить MetaMorph.
5. Задайте следующие условия сбора данных. Время экспозиции: 30 мс для фазового контраста, 500 мс для CFP и YFP. Интервал: 30 сек.
6. Начать запись.
7. Через 10 мин добавить 1 мл среды, содержащей EGF, с помощью инжектора (рис. 7601).
8. Остановить сбор данных через 20 мин.

8.1.3 Данные:

8.2 Визуализация активности тирозинкиназы с помощью Picchu

Изображение Пикчу в ячейках COS1: mov8201.mpeg Верхняя панель, фазовый контраст; нижняя панель, FRET

Это исследование поддержано Министерством образования, культуры, спорта, науки и технологий (MEXT) Японии.

Кафедра биоимиджинга и клеточной сигнализации, Высшая школа биологических исследований, патологии и биологии болезней, Высшая школа медицины, Университет Киото