Лада nfr: Купить LADA (ВАЗ) Kalina NFR с пробегом по цене от 700 000 рублей

Характеристика клеточной поверхности и цитозоля iATPSnFR ^1,0 в астроцитах и ​​нейронах. a Одна плоскость из конфокального z-стека клеток U373MG, экспрессирующих цитоплазматическую mCherry и отображающую на мембране iATPSnFR ^1,0 . b Конфокальные изображения клеток U373MG, экспрессирующих iATPSnFR ^1,0 , до применения АТФ (контроль) и во время применения 300 мкМ АТФ (+АТФ), а также изменение флуоресценции (d F ). c Конфокальные изображения нейронов гиппокампа до аппликации АТФ (контроль) и во время аппликации 1  мМ АТФ, а также изменение флуоресценции (d F ). d , e Кривые доза-реакция для iATPSnFR ^1,0 при отображении на поверхности нейронов астроглии U373MG и гиппокампа. f Конфокальное изображение клетки астроглии U373MG, трансфицированной iATPSnFR ^1,0 , до введения 3  мМ АТФ (контроль), во время воздействия (АТФ), а также изменение флуоресценции (d F ). Средний след от всех клеток с с.э.м. также показано. г Репрезентативный астроцит гиппокампа в остром срезе головного мозга, экспрессирующий iATPSnFR ^1.0 до применения АТФ (контроль), во время применения 3 мМ АТФ (АТФ) и dF. Средний след от всех клеток с с.э.м. также показано. ч Сводка диаграммы рассеяния эффекта 3  мМ АТФ на iATPSnFR ^1,0 выражена в указанных типах клеток. На панели ( h ) кружок представляет среднее значение, прямоугольник — стандартную ошибку, усы — стандартное отклонение, а горизонтальная линия — медиану. p Значения показаны для статистического сравнения с контрольным буферным раствором с использованием непарных тестов Стьюдента t .Сокращения: гиппокамп тазобедренного сустава, SC спинной мозг, MSNs средние шипиковые нейроны. Обратите внимание на сломанные оси и . На других панелях планки погрешностей представляют собой sem. а в некоторых случаях меньше, чем символы, используемые для среднего значения. n числа указаны на панелях рисунка и относятся к количеству клеток D промоутер ³⁸ .После микроинъекций in vivo в гиппокамп iATPSnFR ^1,0 совместно локализовался с S100β-положительными астроцитами, но не с NeuN-позитивными нейронами (дополнительная фигура ³ ). Нанесение АТФ в ванну с многоклеточными препаратами, такими как срезы головного мозга, сопряжено с проблемами, вызванными быстрым гидролизом АТФ эктоАТФазами клеточной поверхности. Чтобы свести к минимуму такие эффекты, мы вдували АТФ через стеклянную пипетку с пикосприцером. Напыление 3 мМ АТФ (в течение 5 с) на астроглию U373MG привело к ~ 0.7 d F / F (рис. ). Подобные, хотя и меньшие, ответы наблюдались, когда мы наносили АТФ на астроциты, экспрессирующие iATPSnFR ^1,0 , в срезах гиппокампа и спинного мозга или на средние шипиковые нейроны D1 или D2, экспрессирующие iATPSnFR, в стриатуме (рис. ). В совокупности эти данные показывают, что iATPSnFR может экспрессироваться и надежно реагировать на поверхности клеток после экспрессии in vivo.

Затем мы исследовали использование цитозольного iATPSnFR ^1,0 для отслеживания внутриклеточного АТФ, который колеблется от 1 до 3 мМ в клетках млекопитающих ³⁹ .Мы экспрессировали цитозольный iATPSnFR ^1,0 в астроглии U373MG и обнаружили значительное снижение внутриклеточной флуоресценции при переходе на 0 мМ глюкозы (дополнительный рисунок ^4a ) или при применении 10 мМ 2-дезоксиглюкозы (2DOG; дополнительный рисунок ^{4b 900). ингибитор гликолиза 40 . Точно так же после экспрессии in vivo с AAV мы измерили значительное снижение уровней внутриклеточного АТФ, о чем свидетельствует флуоресценция iATPSnFR 1.0 в астроцитах гиппокампа в 0 мМ глюкозы (дополнительная фигура 4c ; флуоресценция коэкспрессированного tdTomato не изменилась, что свидетельствует об изменении формы и объема клеток или других неспецифических артефактах в качестве причины). Мы повторили эти эксперименты для астроцитов гиппокампа и пирамидных нейронов CA1, как в соматах, так и вдоль отростков (дополнительная фигура 4d ): кислородно-глюкозная депривация (OGD) вызывала значительное снижение внутриклеточного уровня АТФ. Мы обнаружили, что снижение флуоресценции астроцитов было вдвое больше, чем у нейронов (дополнительный рисунок).Такие ответы были полностью обратимы для астроцитов, но лишь частично обратимы для нейронов (дополнительная фигура 4d ). Кроме того, для начала снижения уровня АТФ в астроцитах потребовалось больше времени (~ 10 минут в OGD). Однако, как только АТФ начал уменьшаться в астроцитах, потребовалось 8,0 ± 0,5 мин ( n  = 37), чтобы уменьшиться на 50%, тогда как в соматах и ​​дендритах пирамидных нейронов СА1 это заняло 13,5 ± 0,8 мин ( n  2)= 6 и 17,4 ± 0,9 мин ( n  = 27) соответственно ( p  < 0.0001 по ANOVA и апостериорным тестам Даннета, здесь ± указывает плюс/минус стандартная ошибка среднего). Основываясь на титровании на рис. , мы оцениваем, что уровни АТФ упали на ~ 0,5 мМ с> 1 мМ. Таким образом, во время депривации глюкозы уровень АТФ в астроцитах быстро падает, но полностью восстанавливается при восстановлении уровня глюкозы. Напротив, уровни АТФ в нейронах падают медленно и не могут восстановиться до нормального уровня в тех же условиях.}

mRuby-iATPSnFR

Мы слили красный флуоресцентный белок mRuby ⁴¹ с N-концом iATPSnFR ^1.0 для создания логометрического датчика (рис.; mRuby-iATPSnFR ^1.0 ). Конструкция mRuby-iATPSnFR ^1.0 была идентична конструкции iATPSnFR ^1.0 по своей чувствительности и вызываемой АТФ d F / F (рис. ). В клетках HEK293 mRuby-iATPSnFR ^1,0 демонстрировал явные изменения зеленой флуоресценции в присутствии 2DOG, тогда как красная флуоресценция mRuby не менялась (рис. ; дополнительная фигура ⁵ ). Обратите внимание, что на дополнительном рисунке ⁵ показано поле зрения, но анализы проводились на отдельных клетках, а не путем усреднения по всем полям зрения.Точно так же после экспрессии AAV in vivo мы измерили значительное снижение внутриклеточного АТФ, о чем свидетельствует флуоресценция iATPSnFR ^1,0 в астроцитах гиппокампа и соматах и ​​дендритах пирамидных нейронов при переходе на растворы, имитирующие ишемию (т. е. OGD), тогда как в mRuby изменений не было (рис.; дополнительная фигура ⁶ ). Интересно, что уровни АТФ возвращались к нормальному уровню при повторном применении физиологических буферов в астроцитах, но оставались низкими в соматах и ​​дендритах нейронов (рис.). Мы также провели два необходимых контрольных эксперимента. Во-первых, мы проверили, реагировал ли сам iATPSnFR ^1.0 на 2DOG снижением флуоресценции. Это было не так (дополнительная фигура ⁷ ). Во-вторых, мы измерили внутриклеточные изменения pH в клетках HEK293 во время применения 2DOG. Используя конфокальную микроскопию (Ex 473 нм, Em 525 нм), мы обнаружили тонкое 10% снижение флуоресценции индикатора pH BCECF, что предполагает подкисление внутриклеточного компартмента на ~0.2 единицы рН. Однако это подкисление заняло ~ 45 минут, чтобы достичь значимости в присутствии 2DOG, и не было обратимым при повторном применении глюкозы (дополнительная фигура ^7b ). Для дальнейшего изучения изменений pH мы также использовали эпифлуоресцентную логометрическую визуализацию с двумя длинами волн с помощью BCECF-AM (Ex 505 и 440 нм, Em 535 нм) и обнаружили, что соотношение 505/440 уменьшилось с 1,3 ± 0,03 до 1,2 ± 0,03 через 20 минут. 2DOG, но не восстановился при повторном применении глюкозы (1,1 ± 0,02) в течение 20 мин ( n  = 144).Следовательно, в соответствии с предыдущей работой с использованием 2DOG ²⁰ мы измерили переменное и незначительное подкисление в клетках HEK293 с применением 2DOG, но эти изменения не могли объяснить падение флуоресценции mRuby-iATPSnFR ^1,0 , которое мы связываем с падением в концентрации АТФ, о которой сообщалось ранее ²⁰ . Например, из калибровочных экспериментов, представленных на рис.  (см. следующий раздел), ожидается, что подкисление с pH 7,4 до 7,2 вызовет снижение флуоресценции АТФ-связанного mRuby-iATPSnFR ^{1 на 9%.0} , тогда как с приложениями 2DOG мы измерили изменение от 40 до 50% (рис. ). Таким образом, в соответствии с прошлыми исследованиями ²⁰ такие предполагаемые изменения АТФ были более значительными, более быстрыми и обратимыми в клетках HEK293 (рис. ). Мы не могли использовать BCECF в качестве индикатора pH для экспериментов со срезами мозга, потому что наша предыдущая работа показала, что органические красители версии ацетоксиметилового эфира (AM), проникающие через мембрану, плохо/ненадежно поглощаются срезами мозга взрослых ^{38 , 42} . В целом, эксперименты mRuby-iATPSnFR ^1,0 позволяют предположить, что этот датчик можно использовать в качестве логометрического датчика клеточно-специфических внутриклеточных уровней АТФ, с той оговоркой, что параллельные эксперименты для оценки изменений pH необходимо проводить в каждом конкретном случае. всякий раз, когда используется mRuby-iATPSnFR ^1.0 . Затем мы непосредственно оценили чувствительность сенсоров к pH.

Характеристика цитозольного mRuby-iATPSnFR ^1,0 . a Мультипликационная схема mRuby-iATPSnFR ^1.0 : Связывание АТФ схематизировано, чтобы показать увеличение флуоресценции cpSFGFP, тогда как флуоресценция mRuby остается неизменной. b Кривые доза-реакция для iATPSnFR ^1,0 по отношению к mRuby-iATPSnFR ^1,0 в клеточных лизатах HEK293. c Изменения флуоресценции mRuby-iATPSnFR ^1,0 (зеленый и красный каналы) до, во время и после ингибирования гликолиза 2DOG в клетках HEK293. d Изменения флуоресценции mRuby-iATPSnFR ^1.0 (зеленый и красный каналы) во время кислородно-глюкозной депривации в срезах гиппокампа головного мозга. Показаны данные по астроцитам, а также телам и дендритам пирамидных нейронов СА1. Столбики погрешностей представляют собой sem. а в некоторых случаях меньше, чем символы, используемые для среднего значения. n Номера приведены на панелях рисунка и относятся к количеству клеток

Оценки влияния pH на iATPSnFR ^1,0 . a–d Влияние рН на несвязанную и связанную с АТФ флуоресценцию указанных конструкций. e , f Сравнение влияния АТФ на флуоресценцию указанных конструкций при рН 6,4 и 7,4. Столбики погрешностей представляют собой sem. а в некоторых случаях меньше, чем символы, используемые для среднего значения. n числа представлены на панелях рисунков и относятся к количеству клеток в панели ( a ) и количеству независимых оценок в ( b – f )

pH-чувствительность iATPSnFR

1. 0

Как и для всех сенсоров на основе GFP ⁴³ , ожидается, что флуоресценция iATPSnFRs будет чувствительна к pH с зависимостью H ⁺ , в значительной степени определяемой GFP. Мы провели определенный набор экспериментов, чтобы оценить это как руководство для будущего использования датчиков. Мы сосредоточились на iATPSnFR ^1.0 , потому что он использовался для большей части работы, представленной в этом исследовании. Во-первых, мы измерили флуоресценцию внеклеточно представленного iATPSnFR ^1,0 на поверхности клеток HEK293 в диапазоне значений pH от 4 до 9 в отсутствие и в присутствии АТФ (рис.). Как и ожидалось, подкисление сильно уменьшило флуоресценцию связанного и несвязанного состояний АТФ. Между pH 6,5 и 9 наблюдалось сильное увеличение флуоресценции при связывании АТФ. Во-вторых, мы повторили описанные выше эксперименты с иАТПСнФР ^1.0 в растворе (из бактериальных лизатов). Мы обнаружили тот же эффект при подкислении для связанного и несвязанного состояний АТФ (рис.  ). В-третьих, мы провели аналогичные эксперименты для сенсора mRuby-iATPSnFR ^1,0 в растворе (из бактериальных лизатов) при оценке эмиссии флуоресценции в зеленом канале сенсора АТФ и в эталонном красном канале mRuby (рис.). Для сенсоров АТФ мы снова обнаружили, что подкисление снижает флуоресценцию связанных и несвязанных состояний АТФ. Влияние рН mRuby не зависело от АТФ, что указывает на то, что mRuby-iATPSnFR ^1,0 можно использовать в качестве логометрического датчика (рис. ). В-четвертых, мы построили кривые доза-реакция АТФ для iATPSnFR ^1,0 и mRuby-iATPSnFR ^1,0 в растворе при pH 6,4 и 7,4 (рис. ). Эти данные показали, что подкисление снижает реакцию флуоресценции при всех концентрациях АТФ, которые были эффективны для усиления флуоресценции.В целом, эти данные показывают, что iATPSnFR ^1.0 и mRuby-iATPSnFR ^1.0 функционируют как одноволновые и логометрические датчики АТФ, но действительно проявляют чувствительность к кислому pH, как и ожидалось по природе GFP ⁴³ . Возможно, более полезным является то, что калибровочные кривые, показанные на рис. , представляют собой показатель, по которому можно судить о последствиях подкисления в будущих экспериментах, в которых используются датчики. Сенсоры, вероятно, будут иметь ограниченное применение в средах, где рН более кислый, чем ~6.2. Наконец, мы оценили кинетику связывания АТФ с iATPSnFR ^1,0 в растворе при pH 7,4 и обнаружили, что они не следовали типичному поведению псевдопервого порядка (дополнительная фигура ⁸ ), а вместо этого соответствовали механизму в в которых возникают как более высокие, так и более низкие флуоресцентные состояния (потенциально возникающие в результате мономерных и димерных состояний). Эту возможность можно с пользой изучить в последующих исследованиях.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы использовали яркий, стабильный каркас cpSFGFP, рациональный дизайн и скрининг библиотеки для выбора датчиков АТФ с желаемыми характеристиками. Мы охарактеризовали датчики АТФ для мониторинга клеточной поверхности и уровней цитозольного АТФ с превосходной специфичностью. Текущие датчики могут быть полезны для изучения уровней цитозольного АТФ и сигналов, связанных с рецепторами P2X7, которые реагируют на АТФ в диапазоне от сотен микромолярных до миллимолярных ⁴⁴ , но они кажутся непригодными для измерения высвобождения АТФ из астроцитов, которое, вероятно, диапазон сотен наномолярных до микромолярных ⁴⁵ . Датчики также могут быть полезны в диагностике для определения высоких уровней АТФ в опухолях ⁴⁶ .Стратегии дальнейшего уточнения рассматриваются в следующих разделах.

Мы свели в таблицу свойства iATPSnFR по отношению к свойствам существующих сенсоров АТФ на основе флуоресценции в дополнительной таблице ¹ . Уровни внутриклеточного АТФ обычно находятся в миллимолярном диапазоне и изменяются при патологии. Уровни внеклеточного АТФ обычно низкие в физиологических условиях из-за эктоАТФаз, но несколько десятилетий физиологических исследований и существование рецепторов АТФ на клеточной поверхности с чувствительностью к АТФ между наномолярными и миллимолярными указывает на то, что уровни внеклеточного АТФ также увеличиваются во время определенных процессов, таких как пуринергическая передача ^{5 , 47 – 52} . Принимая во внимание эти факты, кажется невозможным, чтобы один датчик подходил для мониторинга внутриклеточных и внеклеточных уровней АТФ в диапазоне концентраций, охватывающем 5–6 порядков. Таким образом, датчики АТФ должны быть разработаны для конкретных приложений из доступных (дополнительная таблица ¹ ) и описанных здесь.

Очевидно, что для лучшего обнаружения небольших колебаний АТФ у живых животных необходимо улучшить чувствительность, d F / F и кинетику иАТФСнФР, что может быть достигнуто с помощью стратегий направленной эволюции с применением иАТФСнФР ^1.0 эшафот нам сообщили. Важные мишени для такого мутагенеза включают линкерные области и сам АТФ-связывающий модуль. Кроме того, можно использовать тот же каркас для разработки сенсоров для других нуклеотидов и нуклеозидов, как при разработке сенсоров NADPH, например, ⁵³ . Несколько таких стратегий находятся в стадии реализации. В этом отношении прогресс в создании других датчиков, таких как датчики для Ca ²⁺ , глутамата и напряжения, освещает: все наилучшие доступные индикаторы были созданы через несколько лет и итеративно после того, как была сообщена полезная отправная точка и стратегия. Вполне возможно, что разработка датчиков АТФ пойдет по тому же пути на основе каркаса iATPSnFR ^1.0 или других. Параллельно, однако, АТФ-рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), которые демонстрируют диапазон сродства к АТФ и лигандной селективности ⁴⁷ , потенциально могут быть использованы для разработки сенсоров АТФ, о чем свидетельствуют недавние впечатляющие успехи, достигнутые с образованием ацетилхолина. и датчики дофамина на основе родственных им GPCR ^{28 – 30} .При оценке этих подходов возможно, что датчики на основе GPCR могут образовывать гетеромеры ^{, , 54, ,} с эндогенными GPCR, тогда как для датчиков, использующих инженерные каркасы, такие как iATPSnFR, такая возможность менее вероятна. Наконец, датчики АТФ на основе GFP, вероятно, найдут много применений для изучения динамики АТФ, и их следует рассматривать как дополнение к использованию подходов к визуализации АТФ на основе люциферазы, которые, как было показано, работают для внутри- и внеклеточного АТФ в клетках и в клетках. vivo ^{16 – 19 , 32} .Например, кажется маловероятным, что датчики АТФ на основе флуоресценции могут быть использованы для визуализации целых грызунов, что возможно для датчиков на основе люциферазы ¹⁹ . Следовательно, выбор используемого датчика будет во многом зависеть от конкретного решаемого вопроса, и в каждом конкретном случае необходимо будет проводить тщательную оценку вклада pH в сигналы.

В целом, описанные здесь iATPSnFR и будущие разработки, которые они позволяют (для адаптации чувствительности и кинетики к конкретным приложениям), предвещают прямую визуализацию пуринергической передачи сигналов ⁵ по всему телу трансгенных животных.Наши конструкции доступны (дополнительная таблица ² ), чтобы позволить начать такие исследования параллельно с существующими подходами, обсуждаемыми в предыдущих разделах.

Методы

Клонирование

Кодирующая последовательность QUEEN-7µ была приобретена в виде фрагмента гена gBlock у Integrated DNA Technologies с сайтом рестрикции BglII , предшествующим кодирующей последовательности QUEEN-7µ, и сайтом рестрикции PstI после кодирования последовательность. Этот gBlock был клонирован в собственный модифицированный вектор pRSET-A (ThermoFisher: V35120), названный pHHM.pHHM содержал N-концевую метку His6Gly, используемую для очистки, за которой следовала метка эпитопа гемагглютинина (HA) и сайт множественного клонирования перед интересующим геном, а также метка myc на С-конце гена. Этот вектор использовали для скрининга, потому что он имеет метки HA и myc, присутствующие в pDisplay (ThermoFisher: V66020), векторе, который мы планировали использовать для поверхностной экспрессии в клетках млекопитающих ^{26 , 55} . Клонирование из pHHM в pDisplay или в pDisplayMini, собственный вектор, в котором отсутствует N-концевой эпитоп HA, присутствующий в pDisplay, было достигнуто с помощью рестрикции плазмид iATPSnFR и pDisplay с BglII и PstI .Клонирование в pZAC-AAV- GfaABC ₁ D проводили с использованием ПЦР-амплификации для добавления сайта рестрикции NheI к N-концу iATPSnFR и сайта рестрикции NotI in к С-концу. кодирующей последовательности iATPSnFR. Клонирование выполняли с использованием обычных методов субклонирования. Обратите внимание, что mRuby, который мы использовали, был mRuby3 минус MDELYK с C-конца.

Экспрессия и очистка белков

Векторы, содержащие варианты iATPSnFR, трансформировали в клетки Escherichia coli BL21(DE3) (без pLysS).Белки экспрессировали путем выращивания E. coli в жидких средах для аутоиндукции ⁵⁶ с добавлением 100 мкг/мл ампициллина при 30°C в течение не менее 18 часов. После экспрессии бактерии собирали при 1500 г в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в PBS с 1М NaCl и замораживали. Белок экстрагировали с помощью лизиса замораживанием-оттаиванием и обработки ультразвуком. После оттаивания к раствору перед обработкой ультразвуком добавляли 1 мкМ PMSF. После обработки ультразвуком сырой лизат сначала осветляли при 4000 г в течение 20 мин.Затем супернатант выделяли и дополнительно очищали центрифугированием при 35 000 g в течение 45 мин. Белки очищали с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе (колонка 5  мл). Белки iATPSnFR элюировали градиентом 120 мл от 0 до 200 мМ имидазола со скоростью 2 мл/мин. Для определения того, какие фракции являются флуоресцентными, использовали коробку с синим светом. Флуоресцентные фракции объединяли и концентрировали до 2–3 мл. Затем белок подвергали диализу с минимум 1 л PBS в течение не менее 24 часов.Среда для автоиндукции состояла из ~900 мл среды ZY (1% триптона и 0,5% дрожжевого экстракта) с 20 мл 50×М (25 мМ Na ₂ HPO ₄ , 25 мМ KH ₂ PO ₄ , 50 мМ NH ₄ Cl и 5 мМ Na ₂ SO ₄ ), 20 мл 50 × 5052 (0,5% глицерин, 0,05% глюкоза, 0,2% 0,05% глюкоза, 0,2% 0,8 М α-лактоза), 20 мл 4 , а 200 мкл 1000 × следовые металлы (50 мм FECL ₃ , 20 мм CaCl ₂ , 10 мм MNCL ₂ , 10 мм ZnSO ₄ , 2 мм COCL ₂ , 2 мм CUCL ₂ , 2 мм NICL ₂ , 2 мм Na ₂ MOO ₄ , 2 мм Na ₂ SEO ₃ , 2 мм H ₃ BO ₃ ).

Титрование белков с помощью АТФ

После экспрессии белка 100 мкл белка переносили в черные 96-луночные планшеты с плоским дном (Greiner). Исходную флуоресценцию анализировали на планшетном флуориметре Safire2 со стопером (Tecan). Длины волн возбуждения/испускания составляли 485/515 нм. Усиление составляло от 80 до 120 В, а полосовые фильтры были 5 нм. Флуоресценцию снова анализировали после добавления 10 мкл раствора АТФ, содержащего от 315 нМ до 100 мМ АТФ, для конечных концентраций АТФ, равных 31.5 нМ–10 мМ. После второго чтения было рассчитано d F / F .

Для экспериментов, проведенных с осветленным лизатом HEK-293, чашки диаметром 10 см трансфицировали интересующим цитоплазматическим геном. Через 24 ч после трансфекции клетки дважды промывали PBS. Третью промывку PBS использовали для отделения клеток. Затем клетки осаждали и белок экстрагировали путем лизиса замораживанием/оттаиванием. pH лизата регулировали соответствующим образом, и лизат концентрировали до 1. 5  мл с использованием центробежного фильтра Amicon. После концентрирования лизата строили кривые доза-реакция, как указано выше.

Для определения рН-зависимости флуоресценции готовили буферные растворы определенного рН (Hydrion Chemvelope) и концентрировали, добавляли очищенный белок до конечной концентрации 0,2 мкМ. Флуоресценцию 100-мкл образцов в трех экземплярах измеряли, как описано выше. Добавляли АТФ (из запаса 200 мМ Mg АТФ) до конечной концентрации 6 мМ и снова измеряли флуоресценцию.

Остановленные кинетики проживания

равные объемы 0,2 мкм очищенный белок в MG -содержащий буфер (10 мМ HEPES, 145 мм NaCl, 2,5 мм KCL, 10 мм глюкоза, 2 мм CaCl ₂ , 1 мм MGCL ₂ , pH 7,4) и АТФ-содержащий буфер (различные концентрации) смешивали во флуориметре с остановленным потоком SX-20 (Applied Photophysics) с точками данных, собираемыми каждую миллисекунду. Возбуждение осуществлялось от светодиода с длиной волны 490 нм. Эмиссия регистрировалась с помощью фотоумножителя и длинноволнового фильтра 510 нм. Реакции смешения проводили в пяти повторах и усредняли. Данные соответствовали уравнению, содержащему два экспоненциальных роста:

F=F0+ΔFmax1*1-exp-kobs1*время+ΔFmax2*1-exp-kobs2*время

Мутагенез

Варианты линкера и точечные мутации были получены по сайту -направленный мутагенез по Кункелю ⁵⁷ с урациловой матрицей. Клетки CJ236 трансформировали многообещающими векторами и выращивали на чашках, содержащих хлорамфеникол, в течение ночи при 37 °C. На следующий день 1 мл культуры LB, содержащей только ампициллин, инокулировали колонией и выращивали при 37 °C при встряхивании до помутнения – обычно около 6 часов.Как только культура становилась мутной, добавляли 1 мкл хелперного фага M13KO7 (NEB: N0315S). После инкубации в течение дополнительного часа культуру размножали до 40 мл культуры LB с ампициллином (без хлорамфеникола) в колбе на 250 мл и инкубировали в течение ночи при 37°С при встряхивании. На следующий день бактерии осаждали при 4000 г в течение 20 мин при 4°С. Супернатант переносили в новую пробирку Falcon объемом 50 мл, содержащую 10 мл 20% ПЭГ в 2,5 М NaCl. После тщательного перемешивания раствор инкубировали на льду в течение 15 мин.Затем фаг осаждали при 4000 г в течение 20 мин. Супернатант удаляли, а фаг ресуспендировали в 2 мл PBS. 2 мл PBS разделяли на две разные пробирки Эппендорфа и центрифугировали на максимальной скорости в течение 5 минут для осаждения оставшихся бактерий. Супернатант переносили в две новые пробирки Эппендорфа, содержащие 300 мкл 20% ПЭГ в 2,5 М NaCl. После встряхивания раствор инкубировали на льду в течение 10 мин. Фаг осаждали на максимальной скорости в течение 5 мин. Супернатант удаляли.Был сделан еще один быстрый отжим для удаления любого остаточного супернатанта. Затем фаг ресуспендировали в 1 мл PBS. Его центрифугировали на максимальной скорости в течение 5 минут, а супернатант переносили в новую пробирку Эппендорфа. Затем урациловую матрицу очищали с использованием набора Qiagen QIAprep Spin M13 Kit (кат. № 27704) по протоколу производителя. 11 мкл буфера MP добавляли к 1 мл раствора PBS/матрицы. После встряхивания смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем эту смесь наносили на спин-колонку QIAprep и центрифугировали при 4700× g .Проток был отброшен. После нанесения всей смеси на колонку наносили 700 мкл буфера PB. Через 1 мин инкубации колонку центрифугировали при 4700× g в течение 15 с. Это повторяли перед трехкратной промывкой колонки 700 мкл РЕ-буфера и снова центрифугированием при 7000 об/мин в течение 15 с. Убедившись, что колонка сухая, на колонку наносили 25 мкл ЭБ, которую затем центрифугировали при 4700× г . Это было сделано три раза для в общей сложности 75   мкл ЭБ.Качество ДНК проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Высококачественные препараты представляют собой одну полосу размером около 1/3 размера плазмиды.

Вырожденные праймеры были разработаны для одновременной мутации двух аминокислот. Это было сделано путем фланкирования вырожденной/мутированной последовательности ДНК примерно 15 основаниями немутированной ДНК с каждой стороны. Вариант QUEEN с заменой cpEGFP cpSFGFP был клонирован с помощью ПЦР. Было проведено несколько циклов мутагенеза для скрининга вариантов с мутациями на стыке PS3 и cpSFGFP (линкер 1) и cpSFGFP и PS3 (линкер 2).В следующих праймерах X обозначает кодон, который был рандомизирован для кодирования всех возможных аминокислот. Праймер линкера 2, кодирующий GHKLEYNXXDIDFKRA, привел к варианту с последовательностью линкера 2 GHKLEYNLHDIDFKRA. Это было повторно рандомизировано с рядом праймеров (многие из которых не дали улучшенных сенсоров), включая праймер, кодирующий GHKLEYNFXLHXIDFKRA, из которого была идентифицирована окончательная последовательность линкера 2 GHKLEYNFGLHDIDFKRA. На этом шаблоне линкер 1 был оптимизирован с помощью праймера, кодирующего AERRLQSQXXSHNVYIT.При проверке нескольких сотен вариантов была идентифицирована победная (и окончательная iATPSnFR ^1.0 ) последовательность AERRLQSQVLSHNVYIT. Праймеры фосфорилировали с использованием киназы Т4. Реакцию проводили в пробирке Эппендорф, содержащей 18 мкл H ₂ O, 3 мкл буфера для киназы Т4, 1 мкл 10 мкМ АТФ, 1 мкл киназы Т4 (NEB M0201L) и 7 мкл 100 мкМ олигоматрицы. Затем реакцию инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Чтобы определить оптимальное соотношение матрицы и праймера, первоначально были проведены четыре реакции отжига с использованием четырех различных разведений праймера с киназой; 1:1, 1:5, 1:10 и 1:100.1 мкл разбавленного праймера, 1 мкл матрицы и 1 мкл 10× буфера для ДНК-лигазы Т4 и 7 мкл воды без нуклеазы объединяли в пробирке для ПЦР. Реакционную смесь нагревали до 95°С в течение 2 мин с помощью ПЦР-машины. Затем реакционную смесь медленно доводили до 25°С, используя шаги по 5°С по 30 с каждый. Для полимеризации ДНК: 9,5 мкл воды, 1,5 мкл буфера 10× ДНК-лигазы Т4, 1 мкл 25 мМ dNTP, 1 мкл 10 мМ АТФ, 1 мкл немодифицированной полимеразы Т7 (NEB: M0274L), 1 мкл лигазы Т4 (NEB: M0202M) , и все 10 мкл реакционной смеси для отжига добавляли в пробирку для ПЦР и инкубировали при комнатной температуре в течение часа.Эту реакцию трансформировали непосредственно в клетки E. coli BL21(DE3) (без pLysS) и высевали на чашки LB-Agar размером 24 см × 24 см с 100 мкг/мл ампициллина. После определения оптимальной концентрации киназных олигонуклеотидов это разведение можно использовать для последующих реакций с этим конкретным урациловым шаблоном.

Высокопроизводительный скрининг

Отдельные колонии отбирали с помощью робота для сбора колоний QPix2 ^xt (Genetix). Колонии помещали в глубокие 96-луночные планшеты, заполненные 800 мкл аутоиндукционной среды с 100 мкг/мл ампициллина.Культуры выращивали при энергичном встряхивании в течение ночи при 30 °С. Бактерии собирали центрифугированием (3000 г ) и трижды промывали 900 мкл PBS перед замораживанием. Белок экстрагировали методом замораживания-оттаивания с использованием 900 мкл фосфатно-солевого буфера. Для гомогенизации раствора использовали быстрое встряхивание. Неочищенный лизат осветляли центрифугированием при 4000 g в течение 30 мин. 100 мкл осветленного лизата переносили в плоскодонные черные 96-луночные планшеты (Greiner) с помощью робота для работы с жидкостями. Исходную флуоресценцию анализировали на планшетном флуориметре Safire2 со стопером (Tecan). Длины волн возбуждения/испускания составляли 485/515 нм. Усиление составляло от 80 до 120 В, а полосовые фильтры были 5 нм. Флуоресценцию снова анализировали после добавления 10 мкл 100 мМ АТФ (конечная концентрация АТФ 10 мМ). После расчета d F / F для многообещающих кандидатов были изготовлены новые матрицы урацила, которые были подвергнуты последующим раундам мутагенеза. Наиболее многообещающие сенсоры были секвенированы и клонированы либо в pDisplay, либо в pDisplayMini для дальнейшего скрининга в клетках млекопитающих.

Трансфекция клеток HEK293 и U373

Клетки HEK293 (ATCC, CRL-1573) и U373MG (Sigma-Aldrich, 08061901) поддерживали в среде DMEM/F-12 с добавлением GlutaMAX (Gibco: 10565042), 10% FBS ( Gibco 10082147) и 5 мл пенициллина-стрептомицина (10 000 ЕД/мл) (Gibco: 15140-122) при 37 °C с 5% CO ₂ . Клетки обрабатывали трипсином, как только они достигали слияния, и разводили в соотношении 1:10. Клетки HEK-293 и U373MG трансфицировали либо липофектамином 2000 (ThermoFisher 11668027), либо эффектеном (Qiagen ID: 301425) в соответствии с рекомендациями производителя.Ниже приведена процедура трансфекции одной лунки 6-луночной чашки. 100 мкл OptiMEM (Gibco: 31985062) помещали в две пробирки. В одну пробирку добавляли 2,5 мкг ДНК, а в другую — 6,25 мкл липофектамина 2000. Содержимое двух пробирок объединяли, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 20  мин при комнатной температуре перед добавлением смеси к клеткам, конфлюэнтным на 70–90% со свежей средой. Среду меняли через 6–8 ч. В пробирку добавляли 0,4 мкг ДНК, а затем 8 мкл энхансера.100 мкл пипетированного буфера ЕС использовали для смешивания содержимого пипетированием. Затем смесь инкубировали в течение 2 минут, прежде чем тщательно смешать с ней 8 мкл Effectene. Затем раствор инкубировали в течение 10 мин. 600 мкл свежей среды добавляли перед добавлением смеси к клеткам, которые были на 70–90% конфлюэнтны со свежей средой. СМИ были заменены на следующий день.

Лизис клеток НЕК293

Клетки НЕК293 трижды промывали холодным PBS перед лизисом клеток. Клетки лизировали на льду с использованием буфера RIPA: 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, 1 % Тритон, 0.1% SDS и 0,5% дезоксихолата натрия при pH 8 с добавлением ингибиторов протеазы (ThermoFisher). После 10-минутной инкубации на льду смесь центрифугировали при максимальной скорости в течение 10-минут. Супернатант брали и разбавляли равным объемом 2× буфера Лэммли для вестерн-блоттинга.

Вестерн-блоттинг

Готовые гели были приобретены в компании BioRad и подвергались анализу в течение 110 мин при 100 В. 1× буфер для прогонки состоял из 3,0 г трис-основания, 14,4 г глицина и 1,0 г додецилсульфата натрия в 1 л воды.Гели переносили на нитроцеллюлозу на 1 ч при 100 В в буфере для переноса 1×. 10-кратный буфер для переноса состоял из 30,0 г Триса и 144,0 г глицина в 1 л воды. 1× буфер для переноса состоит из 10% рабочего буфера 10×, 20% метанола и 70% воды. После переноса блоты блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) (Sigma: A9647-100G) в TBS с 0,05% Tween-20 (TBST) (Sigma: P2287-100ML) в течение 1 часа. Антитела получали с 5% BSA в TBST. Первичные антитела: мышь GAPDH 1:5000 (Thermofisher MA5-15738).GFP 1:1000 кролик (Invitrogen A11122). Вторичные антитела: IRDye 680RD антимышиные 1:20000 (Licor 926-68170). IRDye 800CW против кролика 1:20 000 (Licor 925-68024). Первичные антитела инкубировали в течение ночи при 4°С. После трех промывок TBST продолжительностью не менее 10 мин каждая вторичные антитела инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Трех промывок TBST продолжительностью не менее 10 мин каждая было достаточно для удаления вторичных антител. Мембраны визуализировали с помощью тепловизора Licor Odyssey.

Микроинъекции AAV2/5 in vivo

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по исследованиям на животных канцлера Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Мыши C57BL/6NTac дикого типа были получены из колоний домашнего разведения или приобретены у Taconic Biosciences. Всех мышей содержали с пищей и водой без ограничений в 12-часовой светлой/темной среде. Все животные были здоровы, без явного поведенческого фенотипа, не участвовали в предыдущих исследованиях и были умерщвлены во время светового цикла. Первоначально животных глубоко анестезировали в камере с 5% изофлураном. Затем голову животного брили, чтобы удалить мех вокруг хирургического участка.Голову животного фиксировали в стереотаксической установке с помощью ушных перекладин. На нос помещали носовой конус для непрерывного введения изофлурана на протяжении всей процедуры. Проводился постоянный мониторинг дыхания животного во время процедуры и соответствующим образом корректировалась анестезия (0,5–3%). Животному вводили бупренорфин (0,1 мг/кг бупренекса), а перед операцией место хирургического вмешательства трижды очищали 10% повидон-йодом и 70% этанолом. Был сделан небольшой разрез, чтобы обнажить череп. С помощью высокоскоростной дрели в черепе было просверлено отверстие ~2 мм на расстоянии 2 мм кзади от брегмы и 1,5 мм слева от брегмы для гиппокампа СА1, а также на расстоянии 0,8 мм кпереди от брегмы и 2 мм слева от брегмы и для дорсолатерального полосатого тела. После удаления части черепа на место хирургического вмешательства наносили физиологический раствор, чтобы удалить любой мусор. В область СА1 гиппокампа вводили 1 мкл вируса (титр 1,5Е13) в течение 5 мин. Используемые стереотаксические координаты: 2 мм кзади от брегмы, 1,5 мм левее средней линии и 1.6 мм от пиальной поверхности для гиппокампа СА1 и 0,8 мм кпереди от брегмы, 2 мм слева от средней линии и 2,4 мм от пиальной поверхности для дорсолатерального полосатого тела. После завершения инъекции игла оставалась на месте в течение 10 минут, чтобы позволить вирусу диффундировать в ткани. Игла постепенно удалялась в течение 2 мин. Операционное поле было ушито. Животные выздоровели в клетке, помещенной на грелку. На следующий день животным давали 0,1 мг/кг бупренекса от боли. После выздоровления за животными наблюдали, чтобы убедиться, что они здоровы, и они получали триметоприм сульфаметоксазол с пищей в течение недели после операции.Нацеливание на MSN было достигнуто с использованием FLEX-зависимого iATPSnFR ^1,0 AAV с селективными линиями мышей Cre ⁵⁸ D1 и D2.

Визуализация

Клетки HEK293 временно трансфицировали вектором, кодирующим лидерную последовательность IgK, за которой следовали iATPSnFR, линкер GGTGGS, метка myc и трансмембранный домен рецептора PDGF. После 24 ч инкубации при 37°С с 5% СО ₂ в 6-луночных планшетах клетки обрабатывали трипсином и высевали на покровные стекла, предварительно покрытые полилизином.После еще 24-часовой инкубации при 37°C с 5% CO ₂ покровные стекла помещали в перфузионную камеру. Изображения были получены с помощью Olympus IXS 71 с использованием масляной иммерсионной линзы UplansApo 40 × 0,90 NA или конфокального микроскопа Olympus BX51WI с иммерсионной линзой LUMPlanFL/IR 40 × 0,80 NA. После помещения в перфузионную камеру клетки перфузировали постоянным потоком свежего буфера HEK293 до и после нанесения лигандов. Растворы АТФ готовили ежедневно. Стационарный уровень флуоресценции рассчитывали как среднее значение изображений, полученных за первые 30 с.Быстрые изменения решения были достигнуты с помощью быстродействующего пошагового контроллера перфузии SF-77B от Warner Instruments. Стеклянный квадрат с тремя цилиндрами (Warner cat 64-0119) помещали как можно ближе к ячейке для целей визуализации. Шаги 800 мкм использовались для перемещения бочек на клетки и от них. Скорость включения и выключения определяли с помощью pClamp 10.6. Буфер HEK: 140 мМ NaCl, 1 мМ MgCl ₂ , 2 мМ CaCl ₂ , 10 мМ HEPES и 10 мМ глюкозы, доведенной до pH 7,4 с помощью 5 мМ NaOH. Оценку внутриклеточного pH проводили с использованием BCECF-AM в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen).Для конфокальной микроскопии мы использовали возбуждение 473 нм и эмиссию 525 нм. Для эпифлуоресцентной микроскопии мы использовали логометрическую визуализацию с чередующимся возбуждением 440 (500 мс), 505 нм (50 мс) и эмиссионной визуализацией 535 нм. В этих экспериментах использовались монохроматор (Till Photonics Polychrome IV или V) и ПЗС (Till Imago от Till Photonics), при этом управление изображением осуществлялось программным обеспечением TillVision.

Животных глубоко анестезировали пентобарбиталом (внутрибрюшинно) перед транскардиальной перфузией.При отсутствии рефлексов вскрывали грудную полость. Левый желудочек прокалывали иглой, соединенной с перфузионным насосом, а правый желудочек пунктировали для обеспечения транскардиальной перфузии. Животным вводили не менее 30 мл охлажденного льдом PBS для полного смыва крови, а затем вводили не менее 30 мл 10% забуференного формалина для фиксации тканей. Ткани аккуратно вырезали и фиксировали в течение ночи в 10% забуференном формалине при 4 °C. Затем ткани подвергали криозащите с помощью 30% сахарозы в PBS, а затем замораживали в O. КТ соединения (Fisher Scientific: 23-730-571). Срезы толщиной 40 мкм собирали с помощью криостатного микротома (Leica). Срезы собирали в PBS и блокировали 10% нормальной козьей сывороткой и 0,5% Triton-X 100 в PBS на 1 ч при комнатной температуре перед окрашиванием. Первичное антитело наносили на ночь при 4°C в PBS с 10% нормальной козьей сывороткой и 0,5% Triton-X 100. После первичного нанесения срезы трижды промывали PBS. Вторичное антитело инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа с последующим трехкратным промыванием PBS перед нанесением на предметные стекла.Срезы полностью высохли на предметном стекле перед нанесением Fluoromount-G (SouthernBiotech: 0100-01). Первичные антитела: S100β кролика 1:1000 (Abcam ab41548). Кролик NeuN 1:1000 (Cell Signaling D3S3I). Цыпленок GFP 1:1000 (Abcam ab13970). Вторичные антитела: козий антикуриный IgG Alexa 488 1:2000 (Invitrogen A11039). Коза против кролика Alexa 546 1:2000 (Invitrogen A11010). Для визуализации красителей Alexa 488 использовался аргоновый лазер с длиной волны 488 нм, отрегулированный на максимальную выходную интенсивность 5–10%. HeNe-лазер 543, настроенный на максимальную выходную интенсивность 20–30%, использовался для визуализации красителей Alexa 546.

Съемник пипеток модели P-97 от Sutter Instrument Co. использовался для извлечения капилляров, приобретенных у VWR (1B100-4). Пипетки с пластырями заполняли 3 мМ АТФ и гидразидом Alexa Fluor 568 (1:200) (ThermoFisher Scientific: A10441). С помощью микроманипуляторов кончик пипетки помещали на 10–20 мкм выше изображаемой клетки. Постоянный поток свежего буфера все время заполнял камеру визуализации. После 30-секундной визуализации через PicoSpritzer III от Intracel вводили 5-секундную затяжку 3 мМ АТФ.

Перед обезглавливанием животных глубоко анестезировали изофлураном. Мозг извлекали как можно бережнее и быстрее, а затем как можно быстрее охлаждали. Мозг прикрепляли суперклеем к режущей платформе и заливали ледяным буфером для срезов гиппокампа, в то время как срезы толщиной 300 мкм собирали с помощью вибратома. Для срезов спинного мозга выполняли ламинэктомию. Твердая мозговая оболочка и все корешки были удалены, после чего спинной мозг с помощью суперклея был смонтирован на агарозном блоке для поперечного среза (300 мкм).Затем эти срезы помещали в буфер для визуализации гиппокампа при температуре 32°C. Все растворы барботировали 95% O ₂ и 5% CO ₂ в течение не менее 30 минут перед нарезкой. После разрезания срезы помещали в перфузионную камеру для визуализации с постоянным потоком 2–3 мл/мин буфера для визуализации гиппокампа. Изображения были получены с использованием конфокального микроскопа Olympus BX51WI с водно-иммерсионным объективом LUMPlanFL/IR 40 × 0,80 NA. Аргоновый лазер с длиной волны 488 нм, настроенный на максимальную выходную интенсивность 10–15% для визуализации GFP.Гиппокампал нарезки буфера: 87 мм NaCl, 25 мм NaHCO ₃ , 25 мм глюкоза, 2,5 мм ККК, 1,25 мм Nah ₂ PO ₄ , 75 мм сахароза, 7 мм MGCL ₂ и 0,5 мм CaCl ₂ . Гиппокампальный визуализационный буфер: 126 мм NaCl, 25 мМ NaHCO ₃ , 10 мМ глюкозы, 2,5 мМ ККЦ, 1,24 мм Nah ₂ PO ₄ , 1,30 мм MGCL ₂ и 2,4 мм CaCl ₂ .

Анализ данных и статистика

Данные каждого эксперимента представляют минимум n мышей (для экспериментов, в которых использовались мыши).Во всех экспериментах по визуализации n было >3 независимых оценок (мыши или трансфекции). Размеры выборки не рассчитывались априори. На панелях рисунка и в подписях и определяются как количество повторов (клеток, дендритов, интересующих областей или оценок в случае биохимических оценок) и обычно относятся к количеству клеток, если не указано иное. Для инъекций AAV мышей случайным образом распределяли в каждую экспериментальную группу. Никакие точки экспериментальных данных не были исключены.Статистические тесты проводились в Origin 9. Сводные данные представлены как среднее  ± sem. Обратите внимание, что на некоторых графиках столбцы, представляющие sem. меньше, чем символы, используемые для представления среднего значения. Для каждого набора сравниваемых данных мы определяли в Origin или GraphPad InStat, были ли данные распределены нормально или нет, используя тест Шапиро-Уилка. Если они были нормально распределены, мы использовали параметрические тесты. Если данные не были нормально распределены, мы использовали непараметрические тесты.Парные и непарные двусторонние критерии t Стьюдента (соответственно) и двусторонние критерии Манна-Уитни использовались для большинства статистических анализов со значимостью, заявленной на уровне p  < 0,05. Когда применялся статистический тест, не являющийся критерием t Стьюдента или критерием Манна-Уитни для конкретного случая, то это указывается в тексте как таковое. На протяжении всей рукописи результаты статистических тестов ( p значений и n чисел) полностью представлены на панелях рисунков, чтобы сэкономить место в основной части рукописи.Используются точные значения p , но когда значение p было меньше 0,0001, оно указывается как p  < 0,0001, поскольку используемая нами программа не дает точных чисел для таких низких значений. Номера n указаны на панелях рисунков и представляют собой дискретные образцы. Однако там, где это уместно, в тексте также приводятся основные статистические данные. Изображения были проанализированы с помощью ImageJ. Плагин GECIquant ⁵⁹ использовался для вычитания фона из изображений, а также для выбора областей интереса.Измерения среднего значения серого были импортированы в Excel для анализа d F / F . Окончательные результаты были представлены в графическом виде в OriginPro 2016, а рисунки собраны в CorelDraw 2017 для создания файлов рисунков в формате TIFF.

КАК СМОТРЕТЬ ПРЯМУЮ ТРАНСЛЯЦИЮ NFR РОДЕО ОНЛАЙН

Привет и добро пожаловать
Национальный финал Wrangler Rodeo начинается в четверг, 2 декабря, и Cowboy Channel+ будет там для всех. Турнир из 10 туров продлится с декабря.2-11 в Лас-Вегасе, и в нем примут участие 15 лучших участников во всем, от езды на быках до борьбы с быками. Конкурсанты ищут призовой фонд в размере 10 миллионов долларов в Центре Томаса и Мака в Лас-Вегасе.

Национальные финальные финалы 2020 Rodeo Rodeo (NFR) в прямом эфире в четверг, 12 декабря.2-11 из Центра Томаса и Мака, Лас-Вегас, начало в 22:00. Восточное время/19:00 PT на канале Cowboy +. В главном в мире родео участвуют 14 лучших участников в езде без седла, борьбе с быками, командной езде на канатах, верховой езде в седле, езде на канатах, гонках на бочках и езде на быках. Таким образом, вы не должны пропустить ни одного момента действия NFR.

Национальный финал Родео в прямом эфире на канале Cowboy+

Смотрите трансляции WNFR в прямом эфире каждую ночь на The Cowboy Channel+ с 10:00. м. – 1:00 (ET) каждую ночь дома. Все, что вам нужно, это настроиться на Dish: Channel 158; Прямое телевидение: канал 221. Или проверьте свои местные списки. Вышеуказанные каналы доступны для США, Канады, Мексики, Бразилии, Великобритании, Австралии и всех международных зрителей. Если вы любите смотреть основные моменты родео NFR, то roartube — лучшее место рядом с YouTube, чтобы смотреть национальные финалы родео.

Раунд 1 национального финала Wrangler
Дата: четверг, 2 декабря | Время: 10 ч.м. ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повторный эфир в 1:00 по восточноевропейскому времени)

Зарегистрироваться на раунд 1

Раунд 2 национального финала Wrangler
Дата: пятница, 3 декабря | Время: 22:00 ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повторный эфир в 1 час.м. ET)

ЗАПИСАТЬСЯ на 2-й раунд

3-й раунд национального финала Wrangler
Дата: суббота, 4 декабря | Время: 22:00 ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повтор в 1:00 по восточноевропейскому времени)

Запись на 3-й раунд

4-й раунд национального финала Wrangler
Дата: воскресенье, 5 декабря | Время: 10 ч.м. ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повторный эфир в 1:00 по восточноевропейскому времени)

Запись на 4-й раунд

5-й раунд национального финала Wrangler
Дата: понедельник, 6 декабря | Время: 22:00 ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повторный эфир в 1 час.м. ET )

ЗАПИСАТЬСЯ на 5-й раунд

6-й раунд национального финала Wrangler
Дата: вторник, 7 декабря | Время: 22:00 ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повтор в 1:00 по восточноевропейскому времени)

Запись на 6-й раунд

7-й раунд национального финала Wrangler
Дата: среда, 8 декабря | Время: 10 ч.м. ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повтор в 1:00 по восточноевропейскому времени)

Запись на 7-й раунд

8-й раунд национального финала Wrangler
Дата: четверг, 9 декабря | Время: 22:00 ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повторный эфир в 1 час.м. ET)

ЗАПИСАТЬСЯ на 8-й раунд

9-й раунд национального финала Wrangler
Дата: пятница, 10 декабря | Время: 22:00 ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повторный эфир в 1:00 по восточноевропейскому времени)

Запись на 9-й раунд

10-й раунд национального финала Wrangler
Дата: суббота, 11 декабря | Время: 10 ч.м. ET
Местонахождение: Thomas & Mack Center, Лас-Вегас
Телевидение: Прямая трансляция на канале Cowboy Channel+ в 22:00. ET (ежедневный повторный эфир в 1:00 по восточноевропейскому времени)

Зарегистрируйтесь для участия в 10-м раунде

Присоединяйтесь к «Ковбойскому Рождеству» в Техасском конференц-центре, South Halls на национальном финале родео, начиная с четверга, 2 декабря, и заканчивая 11 декабря! И не забудьте надеть розовое платье на мероприятие Tough Enough to Wear Pink Night, спонсируемое Montana Silversmiths, которое состоится 11 декабря в Центре Томаса и Мака . Пока вы находитесь в Wrangler NFR, зайдите и сделайте покупки в South Point Western Gift Show в выставочном зале South Point и в зале Boot Barn и обязательно посетите обед Miss Rodeo America PRCA в MGM Grand Conference Center # Room 319- 320.

Wrangler NFR проводится каждый декабрь в Центре Томаса и Мака в Лас-Вегасе по контракту с Ассоциацией профессиональных родео-ковбоев (PRCA), который действует до 2024 года, кошелек в 2018 году составляет 10 миллионов долларов. Квалификация основана на мировом зачете PRCA 2018 года.

О Wrangler NFR
Стандартные родео-состязания включают езду без седла, борьбу с быками, командную езду на канатах (хедлеры и хилеры), езду в седлах на бронях, езду на веревках, гонки на бочках WPRA и езду на быках. Это захватывающий вид спорта, который требует терпения, храбрости и просто щепотки безумия, чтобы показать себя хорошо. Чемпион определяется по доходам за сезон. Каждый участник будет выступать один раз в день. В конце каждого раунда в каждом событии есть два чемпиона. Лучшее совокупное время / результат в конечном итоге выиграет событие.

Cowboy Channel+ предоставляет возможность смотреть Wrangler NFR и другие чемпионаты в течение всего года. Всегда что-то происходит, и это событие, в частности, обещает быть захватывающим по множеству причин. В родео скрыта скрытая опасность, которая делает их интригующими, и следующие 10 дней будут очень интересными для этого события.

Ларсен гордится ранговыми поездками

Орин Ларсен едет на Mr. Harry Стейса Смита Pro Rodeo и занимает место в восьмом заезде в четверг на национальном финале Wrangler Rodeo.
(ФОТО РОББИ ФРИМЭНА)

ЛАС-ВЕГАС – За 12 лет верховой езды на неоседланных лошадях в PRCA Орин Ларсен известен тем, что ездит на высококлассных бронзах.

Он доказал это в четверг, набрав 84,5 балла на Mr. Harry Стейса Смита Pro Rodeo и финишировав четвертым в восьмом круге. Это стоило 11 321 доллар и доказывало, что, когда канадский ковбой набирает обороты, он просто позволяет этому катиться. Он занимает третью ночь подряд и заработал 52 673 доллара, большая часть которых пришлась на 6-8 раунды.

«Возможно, я не выигрываю («Eliminator Pen») каждый год, но, похоже, я занимаю довольно хорошие места», — сказал Ларсен из Инглиса, Манитоба, который сейчас живет в Геринге, штат Небраска. «Я просто очень люблю этих действительно сильных лошадей, которые проверят вас и заставят заработать. Когда у вас 90 баллов, это похоже на поездку на 90 баллов.

«Каждый раз, когда вы можете поместить в E-pen в финале, это очень хорошее чувство».

Ларсен занимает пятое место в общем зачете с 677 баллами за восемь поездок.5 баллов. Если он останется на этой позиции, когда NFR завершится в субботу, он добавит бонус в размере 23 513 долларов. Если он переместится на одну позицию вверх, на четвертую, бонус увеличится почти до 33 000 долларов. Он мог использовать любые деньги, которые он мог получить. Он занимает 11-е место в мировом зачете с $150 516.

«Я столкнулся с мистером Гарри в этом раунде два года назад, и я чувствовал то же самое», — сказал он. «Это просто бой. С того момента, как ты киваешь головой, это просто постоянная битва все время. Ричи (Чемпион) связался с ним ранее на этой неделе и сказал то же самое, так что я знал, чего ожидать.

«Я готов к веселью. Мне нравится залезать на электронные ручки и как бы показываться и показываться на них, но в раздевалке становится более оживленно, когда возвращаются «Хопперы».

Вот что произойдет в пятницу. Всадники без седла делают небольшой перерыв после того, как садятся на самых крутых лошадей. У них будут лошади в девятом раунде, что позволит им быть немного более яркими с их шпорами. Это делает его немного веселее.

У него тоже нет времени беспокоиться о своей ничьей.Между выполнением спонсорских обязанностей и другими делами, которыми он занимается в течение дня, он также находит время, чтобы сосредоточиться на своем теле.

«Мой мануальный терапевт из дома Advantage Chiropractic & Acupuncture прилетел посмотреть несколько последних сеансов, — сказал Ларсен. «Он спустился и поработал надо мной, прежде чем я пошел на родео, и это очень помогло.

«Постучи по дереву, у меня совсем не болит. Я первый год не болею. Я не знаю, был ли я просто готов больше, чем когда-либо прежде, но у меня никогда не было такого чувства жесткой болезненности.У нас есть шишки и синяки на этом пути, но это только часть».

Все это помогает ему показывать лучшие результаты каждую ночь, и это главная причина, по которой он участвует во второй половине чемпионата этого года.

Предоставлено twisTEDrodeo.com

NFR Прямая трансляция 2022 года Смотреть национальный финал Родео онлайн – Thalaipuseithhi

Еще одной отличительной чертой этого мягкого прожектора являются его 2 необычайно интенсивных источника света, которые могут излучать 1500 люмен.Солнце имеет 270 диапазонов и 5-летний срок службы батареи, а также светодиоды, встроенные внутрь. Мягкий фотоэлектрический поток Richarm активируется мгновенно на закате, и он фактически отключится сразу же на рассвете, если вы активируете 42 светодиодных индикатора.

Эти прожекторы работают на солнечной энергии и могут освещать дорожки, подъездные пути, пешеходные дорожки, а также внешние зоны под любым углом. К счастью, прожектор SolarBright представляет собой фотогальваническую лампу с долговечной батареей, которая работает весь вечер.Вы можете сделать установку самостоятельно, и всего за пару минут у вас уже может быть несколько ярких огней на вашем дворе.

Если вы ищете эффективное и яркое освещение снаружи, но не хотите много искать, попробуйте CLY 60 LED Photo voltaic Floodlight. Фотогальванический прожектор GLORIOUS-LITE обеспечит именно это, если вам нужен необычайно яркий свет.

Светильники на солнечных батареях являются одними из самых удобных инвестиций, которые вы могли бы сделать для своего малого бизнеса или дома.Что касается недостатков, то солнце обычно не длится 8 часов, потому что это зависит от климатической ситуации и, кроме того, от состояния фотоэлектрической панели.

Как правило, нам нужны прожекторы для укрытия или освещения места, и хотя мы не можем рисковать, что они исчезнут на нас для любого вида деятельности. Как покупатели, нам нужны лампы, которые можно использовать в течение очень долгого времени. Затем подключите прожекторы к Wi-Fi, используя прилагаемый кабель Ethernet.

Эти фотогальванические прожекторы имеют 120 светодиодов.Хрупкие датчики движения могут быть очень полезным дополнением для целей безопасности, и вы не захотите беспокоиться весь вечер, осознавая, что батарея будет стоить, когда наступит день, как только снова.

К недостаткам относится то, что солнечный свет обычно не длится 12 часов, и, кроме того, это связано с тем, что время освещения зависит от местных погодных условий, и солнечные лучи лучше всего освещают свое место. Как было указано ранее в этом обзоре, прожектор SolarBright можно оставить включенным во всех трех режимах: «Полностью вкл.», «От затемнения до сияния» или «Упражнение с блеском».

BassCliff с ANB в Gilley’s Las Vegas (NFR), 14-15 декабря 2018 г. (видео добавлено!)

Хорошо, хотите верьте, хотите нет, но в субботу вечером мы снова хорошо провели время. Всю ночь стояла очередь, чтобы попасть внутрь, но персонал там начал узнавать басиста, так что мне не пришлось платить входную плату, чтобы войти на этот раз.

Но я забегаю вперед. После того, как мы вернулись из Sands Exposition Center, где мы делали подкаст для «Иисус зовет», я понял, что очень голоден.Было 4 часа дня, и я не ел весь день. Итак, я направился в столовую для сотрудников. У меня есть карта питания, которая позволяет мне питаться бесплатно, как и всем остальным сотрудникам.

Поскольку я обычно ем только один раз в день, когда нахожусь в Вегасе, я снова накормил себя белком и овощами. Рыба, сосиски, стейк Солсбери, черная фасоль, большой салат, немного брокколи на пару и одна фаршированная ракушка для макарон. Мне нужно было всего несколько углеводов.

Позже я подготовился к шоу и зашел в магазин в казино, чтобы забрать свою ROCKSTAR.Это не только повышение энергии, но и повышение эго.

Я рано добрался до хонки-тонка. Родео только что закончилось на большом экране. Там было много людей, просто чтобы посмотреть на родео.

Я встретил @G19Tony, и он купил мне пива, прежде чем мы начали. Спасибо, мой друг! Затем мы поднялись на сцену, чтобы позволить DJ Shaddix объявить нас.

Тогда мы начинаем шоу! Давай Аманда!

Когда Аманда поет свои дерзкие девчачьи песни, перед ней всегда танцуют несколько дерзких девчонок.

Рэнди скользит и скользит по стали. Арни корчит гитарное лицо. Аманда заставляет нас хорошо выглядеть и звучать лучше.

У Джейсона было много дел сегодня вечером. Поскольку Джонни не было сегодня вечером, он также играл партии Джонни (которые мы записали ранее) на том причудливом трековом проигрывателе Roland, который он использует.

Вот несколько фотографий половины группы в движении. Я уверен, что объяснения не нужны.

Было очень весело. Всю ночь мы играли только три или четыре линейных танца. Эти люди любили свои два шага и свинговые танцы. На этом снимке ди-джей играл линейный танец во время нашего перерыва. Вы можете увидеть, как народ танцует в задней части танцпола, а другие танцуют свинг в передней части зала.

Три волосатых мальчика на перемене.

Эй! Посмотрите, кто ходил на месте. Наш друг Тамми. Ты помнишь ее по концерту Swallows Inn, верно?

Вот еще одна моя фотография с Тамми и Рэнди, просто так.

Затем мы вернулись на сцену, и танцоры снова оказались на полу. Черт, но это была веселая ночь.

Этот концерт довольно уютный. Мы начинаем в 10 вечера и играем часовой сет, делаем получасовой перерыв, играем 45-минутный сет, делаем получасовой перерыв и играем еще 45-минутный сет, чтобы закончить ночь в 13:30. Вот банда начинает собираться.

Я отключил свою бас-гитару, положил ее в футляр и ушел оттуда примерно через 5 минут. Мне нравится быть басистом. Я даже не привожу на этот концерт усилитель, только IEM и бас. Я подключаюсь к домашнему DI-блоку и готов к работе. Звукорежиссеры любят меня, потому что им никогда не приходится возиться с басом. Я делаю проверку звука одной ноты, и я готов к работе.

В любом случае, все, что осталось, это ехать домой, что всегда занимает больше времени, чем дорога сюда. По крайней мере, я смогу посмотреть на пустынный пейзаж по дороге домой. Спасибо всем, кто делится с нами своими выступлениями здесь.Спасибо, что посмотрели на меня. У меня будет пара выходных, а потом мы будем играть в Stillwater Spirits and Sounds в Дана-Пойнт. До скорой встречи.

Спасибо за снисходительность,

BassCliff

Кураторы Дубии беспокоятся о пленках Никсона

Кампания Джорджа Буша-младшего выразила озабоченность по поводу публикации 420 часов секретных записей Белого дома бывшего президента Никсона. На пленках есть голос отца кандидата в президенты, бывшего президента Джорджа Буша.

Джордж Буш разговаривает или о нем говорят в более чем 100 из 4140 разговоров, которые должны быть обнародованы Национальным архивом. На пленках записаны разговоры конца 1971 года, когда бывший президент был послом США в ООН.

«Мы действительно звонили, чтобы выразить беспокойство», представитель кампании Буша Ари Флейшер заявил в среду вечером. «У нас есть постоянная озабоченность по поводу того, собирается ли эта администрация создавать внешние события, чтобы повлиять на исход этих выборов.»

«Мы выразили озабоченность по поводу сроков. Нам сказали, что это заранее определенные даты (для выпуска магнитофонных лент Никсона), и мы это принимаем», — сказал Флейшер.

В четверг архивы планируют обнародовать более 4000 разговоров, записанных Никсоном в период с августа по декабрь 1971 года. Ключевые республиканские фигуры, которые могут быть на записях, могут повлиять на кандидатуру его сына на пост президента всего за две недели до выборов.

Джон Х. Тейлор, исполнительный директор Фонда библиотеки и места рождения Ричарда Никсона в Йорба Линда, Калифорния, знаком с выпускаемыми пленками Никсона.

«Я в значительной степени знаком с содержанием выпуска. Я могу заверить вас, что нет абсолютно ничего, что нанесло бы ущерб семье Бушей», Тейлор.

Предвыборный штаб Буша подверг резкой критике членов кабинета президента Клинтона за то, что они поддержали предвыборную кампанию демократа Эла Гора.

«Мы обеспокоены тем, что эта администрация делает что-либо, что может дискредитировать республиканцев», — сказал Флейшер.

Флейшер сказал, что кампания выразила свою обеспокоенность Джиму Чиккони, который работал в Белом доме Буша и помог создать президентскую библиотеку Буша. Затем Чиккони позвонил директору Национального архива Джону Карлину, чтобы узнать о выпуске ленты Никсона, сказала Сьюзан Купер, пресс-секретарь архива.

Она сказала, что не знает, просил ли Чиккони архивариуса отложить публикацию записей до окончания выборов.

Никсон установил свою систему записи в Белом доме в начале 1971 года. Существование системы записи было раскрыто во время дачи показаний в Уотергейтском комитете Сената в 1973 году. Правительство конфисковало записи, когда Никсон ушел в отставку. После долгих лет судебных тяжб Национальный архив начал выпускать партии записей, о которых раньше никто не слышал.

CBS Worldwide Inc. Все права защищены. Этот материал нельзя публиковать, транслировать, переписывать или распространять.Ассошиэйтед Пресс способствовало этому отчету

Актуальные новости

Загрузите наше бесплатное приложение

Для последних новостей и анализа Загрузите бесплатное приложение CBS News

.

No related posts.