Ладп: Официальный сайт LADA

Содержание

Официальный сайт LADA

25.05.2021

Лидеры российского рынка автострахования совместно с АВТОВАЗом запустили массовые программы доступно

«Ингосстрах», «АльфаСтрахование», «Согласие», «Росгосстрах» и «ВСК» запустили специальные программы «умного» страхования (основанное на данных о фактическом использовании или UBI) для автомобилей LADA, подключенных к телематической платформе LADA Connect. Проект направлен на развитие рынка добровольного страхования автомобилей массового сегмента. Первым участником программы станет самый продаваемый в России автомобиль – LADA Granta. Новые массовые программы UBI сделают страхование существенно доступнее. При покупке автомобилей, оснащенных LADA Connect, единоразовая дополнительная скидка на полис КАСКО составит 10%. Кроме того, владельцы «подключенных» автомобилей смогут получать дополнительную скидку при продлении договора страхования до 30% в зависимости от качества вождения (скоринг вождения выполняется автоматически на основе данных телематики LADA Connect).

Оливье Морне, вице-президент по продажам и маркетингу марки LADA: «LADA Connect – это новый уровень сервиса и комфорта для наших клиентов. Интеграция технологий Connected Car на этапе производства выполняет еще и важную социальную функцию, повышая доступность добровольного страхования. «Умное» страхование позволяет заметно снизить стоимость полиса. До этого момента его развитие, особенно в массовом сегменте, осложнялось тем, что затраты на установку оборудования могли себе позволить не все автовладельцы и страховые компании. Мы решили данную проблему на системном уровне». Автомобили Granta, оснащенные LADA Connect, уже доступны к заказу в Москве и Московской области, Санкт-Петербурге, Самарской области, Татарстане и в Пермском крае, а в ближайшие месяцы – по всей официальной дилерской сети.Работа LADA Connect основана на техническом решении компании «Лаборатория умного вождения», часть которого – телематическая платформа со специальной системой страхового скоринга обрабатывает данные о вождении и с согласия автомобилиста передает их страховым компаниям.
На основе этих данных формируются индивидуальные предложения. Директор по развитию ООО «Лаборатория Умного Вождения» Тимур Кузеев: «Запуск LADA Granta, оснащенных LADA Connect, – эпохальное событие для страхового рынка России. Мы совместно с АВТОВАЗом и лидерами нашего страхового рынка проделали серьезную работу и создали уникальный для массового сегмента продукт, учитывающий лучшие международные практики и опыт, который в перспективе нескольких лет может вывести нашу страну в мировые лидеры по количеству программ UBI. Это значительно повысит инвестиционную привлекательность нашего рынка для глобального автобизнеса». Индивидуализация страховых тарифов выполняет ряд важных общественно значимых функций. По мнению участников рынка, распространение UBI-программ приведет к заметному повышению безопасности движения, сделает страховые продукты доступными для начинающих водителей, прививая им ответственный подход к использованию автомобиля, снизит уровень страхового мошенничества и обеспечит доступ к КАСКО в массовом сегменте, изменяя отношение к страхованию в обществе.
Член правления ПАО «Росгосстрах» Елена Белоусенко: «Запуск UBI-программ для LADA Granta, оборудованных LADA Connect, приведет к повышению устойчивости и стимулирует развитие российского рынка автострахования. Индивидуализация скоринга по характеру вождения, позволяет персонализировать оценку. На практике это означает, что для клиента отпадет необходимость платить за чужие риски, и мы сможем предлагать более доступные тарифы, которые сделают КАСКО привлекательным продуктом в массовом сегменте. Мы рады быть участником такого масштабного проекта и считаем, что именно «умное» страхование – это ключевой фактор формирования массового устойчивого страхового рынка».При пролонгации скидка за аккуратное вождение будет суммироваться со стандартным страховым коэффициентом бонус-малус, что снизит стоимость полиса для аккуратных водителей до 50%. Такое снижение цен, как ожидают страховщики, позволит заметно повысить проникновение добровольного автострахования в нашей стране.Директор по маркетингу АО «РН-Банк» Алла Кибизова: «РН Банк, как оператор программ страхования для брендов Альянса, в который входит бренд LADA, видит своей миссией предоставление максимального уровня сервиса клиентам Альянса.
Запуск «умного» страхования, с одной стороны, позволит клиентам LADA получать более выгодные условия по страхованию от крупнейших страховщиков, а c другой – выступит драйвером для дальнейшего развития технологий «умного» страхования на российском рынке. Мы видим запуск такого масштабного проекта примером успешной коллаборации крупнейших игроков автомобильного и страхового рынков с целью создать уникальный продукт с высокой клиентской ценностью».Платформа LADA Connect работает по принципу «черного ящика», собирая данные, которые помогают восстанавливать обстоятельства ДТП. Это упрощает и существенно ускоряет процедуру страхового урегулирования, позволяя для удобства автомобилистов частично автоматизировать бюрократические процедуры и переносить их в онлайн. Кроме того, за счет интеграции этой технологии у автовладельцев появится возможность урегулировать убытки без предоставления справок из компетентных органов по событиям, зафиксированным платформой LADA Connect. Заместитель генерального директора по розничному бизнесу СПАО «Ингосстрах» Алексей Власов: «Мы активно работаем с «умными» программами с 2015 года, но их доля в структуре нашего портфеля пока невелика.
Причина в достаточно высоких операционных расходах на само оборудование, его установку и подписку на информационный обмен. При этом выгоды таких программ очевидны для нашей компании как в части сбора скоринговых данных и возможности контроля убытков, так и в части развития продуктового предложения «Ингосстраха». Мы крайне позитивно оцениваем внедрение Connected Car с телематическим функционалом от крупнейшего автопроизводителя в стране». Одним из преимуществ LADA Connect является пересекающаяся интеграция данных, которая создает единую экосистему коммуникации между партнерами и участниками проекта. Например, автовладелец сразу после оформления договора страхования сможет видеть условия страховой программы в мобильном приложении LADA Connect. Там же он сможет отслеживать свой текущий скоринговый балл для скидки на пролонгацию. Руководитель практики Affinity ООО «Страховой Брокер Виллис СНГ» Аррожейро Элдер Жорж Мартинью и Генеральный директор ООО «АСТ» (генеральный партнер Willis Towers Watson по розничному автострахованию в России) Каро Карапетян: «Оформление договоров страхования в дилерских центрах LADA реализуется через централизованную IT-систему выпуска полисов, разработанную партнером RCI Group (АО «РН-Банк» - банк Альянса Renault-Nissan-Mitsubishi) международным брокером Willis Towers Watson (NASDAQ: WLTW), внедренную и обслуживаемую совместно с ООО «АСТ».
Это позволяет оптимизировать процесс работы со страховой документацией в одной системе, а также вести единую отчетность со страховщиками. Процесс полностью автоматизирован для дилеров и автопроизводителя, что значительно упрощает процесс работы и управления. Внедрение «умных» программ позволит реализовать дополнительную сервисную поддержку для Клиентов и значительно упростит сопровождение при наступлении страховых случаев». Мировая практика развития «умного» страхования предполагает два пути. Первый – интеграция телематических решений страховыми компаниями, которые продают или дают в аренду «черные ящики» автовладельцам на время действия полиса. Второй – формирование страхового продукта на основе данных, собираемых системой, интегрированной на этапе производства. Второй подход привел к бурному росту «умного» страхования в ЕС, США и Китае в последние годы. В России в силу низкого проникновения добровольного автострахования и исторических особенностей рынка первый путь оказался неэффективен.
На этом фоне интеграция телематических систем такими крупными производителями, как АВТОВАЗ, будет стимулировать рынок и повлечет за собой существенный рост проникновения не только «умного» КАСКО, но и добровольного автострахования в целом.Заместитель генерального директора по развитию бизнеса ВСК Ольга Сорокина: «Мы рады старту нового проекта с АВТОВАЗом. Недавно мы обновили программу «Умное КАСКО» для удобства потребителей, оптимизировав внутренние процессы компании с интеграцией оператора телематики. Запуск серийного производства автомобилей LADA с телематической платформой Connected Car позволит реализовать специальные страховые программы и предложить новые возможности для наших клиентов. Благодаря проекту аккуратным водителям будут доступны более персонифицированные условия страхования по КАСКО, дополнительная скидка на страховку автомобиля».По данным ЦБ в 2020 году проникновение КАСКО к ОСАГО в России составило 9,6%. Это очень скромный по мировым меркам результат. Для сравнения, в ЕС этот показатель достигает 78%.
Распространение «умного» страхования в массовом сегменте рынка позволит увеличить его, не повышая убытки страховых компаний, что в перспективе может привести к еще большей доступности добровольного страхования.Директор департамента андеррайтинга автострахования АО «АльфаСтрахование» Илья Григорьев: «Наша компания стратегически нацелена на развитие современных программ и технологий, позволяющих улучшать качество клиентского сервиса и портфеля. Благодаря запуску LADA Granta, оснащенных LADA Connect, мы видим большие возможности синергии использования сервисов Connected Car и потенциал для развития современных страховых программ». Лежащая в основе принципа работы «умного» страхования индивидуализация страхового предложения происходит на основе данных о фактическом вождении – сколько и где автомобиль ездит, как часто водитель нарушает правила, превышает скорость или совершает опасные маневры. Сбор этих данных происходит тремя путями: через так называемые «черные ящики» – стационарно установленные в авто подключенные к сети интернет-устройства с акселерометром и GPS/ГЛОНАСС чипом, через мобильные приложения или простые GPS-трекеры.
АВТОВАЗ пошел по самому технологичному и перспективному пути, выбрав для своих автомобилей продвинутую «подключенную» систему, которые в мировой практике пока редко применяется при производстве автомобилей массового сегмента. Андрей Ковалев, Директор по розничному андеррайтингу и партнерским продажам страховой компании «Согласие»: «ООО «Согласие» является партнером LADA Страхование с момента запуска программ от автопроизводителя в партнерстве с АО «РН-Банк». Мы следили за ходом реализации проекта и ждали запуск LADA Granta, оснащенных LADA Connect. Функционал автомобиля и телематической платформы позволяет нам вести контроль статистики и убытков в режиме онлайн. В наших планах наращивать продажи специальных программ для «подключенных автомобилей» — это позволит вывести управление продуктами на новый современный уровень и предложить для наших клиентов новые сервисные возможности». LADA Connect позволяет владельцу удаленно управлять функциями автомобиля при помощи смартфона, а также получать статистическую информацию об использовании автомобиля, которая помогает контролировать эксплуатационные расходы и вести удаленную коммуникацию с дилерскими центрами LADA и Автопроизводителем.
Генеральный директор «Лаборатории Умного Вождения» Михаил Анохин: «Создание современной цифровой экосистемы вокруг автомобилей LADA открывает новые возможности для автовладельцев и связанных с автомобилями бизнесов. Запуск программ доступного UBI-страхования стало одним из первых подобных решений. Надеюсь, что наши совместные разработки послужат надежным связующим звеном между страховыми компаниями и автомобилистами и это позволит покупателям LADA получить самый доступный и удобный страховой продукт на рынке».***Контакты PR-Служб: АО «АВТОВАЗ» - (8482) 75-77-15, +7 (499) 263-08-50, e-mail: [email protected] ПАО «СК «РОСГОССТРАХ» - Бирюков Андрей Аскольдович (Andrey Biryukov), Руководитель блока PR ПАО «СК «РОСГОССТРАХ», Моб.: +7-910-404-94-56, e-mail: [email protected]СПАО «Ингосстрах» - Людмила Мегаворян, Пресс-секретарь, Моб.: +7 915 402 02 10, [email protected] САО «ВСК» - Ларин Павел, Руководитель направления по связям с общественностью Департамент маркетинговых коммуникаций и PR, Блок развития бизнеса, Тел.
: +7 (495) 7274444, доб. 2962, Моб.: +7 926 503-17-00, [email protected] ООО «СК «Согласие» - Елена Григорьева, Моб.: +7 903 599 35 59, Олеся Карпова, Моб.: +7 926 911 00 38, e-mail: [email protected]АО «АльфаСтрахование» - Карцева Мария, Руководитель PR-Службы АО «АльфаСтрахование», Моб.: +7 962 923-74-49, e-mail: [email protected] ООО «АСТ» - Наталья Дегтярева, Директор по маркетингу и развитию, Моб.: +7-903- 100-45-72, e-mail: [email protected] ООО «Лаборатория Умного Вождения» - Александр Корольков, +7-915-497-65-75, e-mail: [email protected] ***Группа ''АВТОВАЗ'' является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Groupe Renault. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для 2-х брендов: LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО ''АВТОВАЗ”, ОАО “LADA Запад Тольятти”, а также в Ижевске – ООО ''LADA Ижевск''. Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в более чем 20 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.ПАО СК «Росгосстрах» — флагман отечественного рынка страхования. На территории Российской Федерации действуют около 1 500 офисов и представительств компании, порядка 300 центров и пунктов урегулирования убытков. В компании работает около 50 тысяч сотрудников и страховых агентов. «Росгосстрах» входит в Группу «Открытие» — один из крупнейших финансовых холдингов нашей страны, и является стратегическим провайдером страховых продуктов и услуг в компаниях группы «Открытие».СПАО «Ингосстрах» - работает на международном и внутреннем рынках с 1947 года, занимает лидирующие позиции среди российских страховых компаний.«Ингосстрах» имеет право осуществлять все виды имущественного страхования, добровольное медицинское страхование и страхование от несчастных случаев и болезней, установленные ст.32.9 Закона РФ «Об организации страхового дела в Российской Федерации», а также перестраховочную деятельность. Компания присутствует в 251 населенном пункте РФ. Представительства и дочерние компании страховщика работают в странах дальнего и ближнего зарубежья.Страховой Дом ВСК (САО «ВСК») работает с 1992 года и является универсальной страховой компанией, предоставляющей услуги физическим и юридическим лицам на всей территории России. Компания стабильно входит в ТОП-10 страховщиков страны по сборам в основных сегментах страхового рынка – автостраховании, страховании от несчастных случаев и болезней (НС) и добровольном медицинском страховании (ДМС). На сегодняшний день более 30 млн человек и 500 тысяч организаций воспользовались продуктами и услугами ВСК. Региональная сеть компании насчитывает свыше 500 офисов во всех субъектах России, что дает возможность эффективно сопровождать договоры страхования по всей стране.ООО «СК «Согласие» входит в единую страховую группу с ООО «Согласие-Вита» и успешно ведет свою деятельность на страховом рынке уже более 27 лет. Внутренняя политика Компании позволяет нам уверенно удерживать высокие позиции на страховом рынке и ежегодно увеличивать число страхователей. Группа «АльфаСтрахование» – крупнейшая частная российская страховая группа с универсальным портфелем страховых услуг, который включает как комплексные программы защиты интересов бизнеса, так и широкий спектр страховых продуктов для частных лиц. Услугами «АльфаСтрахование» пользуются более 31 млн человек и свыше 106 тыс. предприятий. Региональная сеть насчитывает 270 филиалов и отделений по всей стране. Надежность и финансовую устойчивость компании подтверждают рейтинги ведущих международных и российских рейтинговых агентств: «ВВ+» по шкале Fitch Ratings, «ВВB-» по шкале S&P и «ruАAA» по шкале «Эксперт РА» и «ААА ru» по шкале «Национального рейтингового агентства».«РН-БАНК» – «Банк Альянса Renault-Nissan-Mitsubishi». Почти вековая история Банковской Группы Рено берет свое начало в 1924 году во Франции. Сейчас Группа представлена в 36 странах мира, а на российском рынке оказывает поддержку клиентам, выбирающим продукцию брендов Альянса, с 2006 года. Приоритетными направлениями деятельности Банка являются: кредитование физических лиц на приобретение автомобилей брендов Альянса, финансирование дилеров брендов Альянса, а также оказание клиентам сопутствующих финансовых услуг. По состоянию на конец 1 квартала 2021 года Банк занимает 52 место по размеру активов среди российских банков по версии Интерфакс, поднявшись на 6 позиций за 15 месяцев.Willis Towers Watson — ведущая международная консалтинговая и брокерская компания, разрабатывающая современные бизнес-решения, которые помогают нашим клиентам по всему миру преобразовывать риски в возможности развития и роста. Наша компания была основана в 1828 г., и в настоящее время насчитывает 45 000 сотрудников, предоставляющих услуги для более чем 140 стран и рынков. «Страховые брокеры «АСТ» - являются одним из ведущих страховых брокеров, оказывающих полный спектр страховых брокерских услуг и услуг в области риск консалтинга с 2007 года. ООО «Страховые брокеры «АСТ» оказывают страховые брокерские услуги по всем видам страхования, а также не противоречащие законодательству Российской Федерации сопутствующие консультационные услуги в области управления рисками.«Лаборатория умного вождения» – российский разработчик универсальной автомобильной телематической платформы и системы LADA Connect. Созданные в «Лаборатории умного вождения» аппаратно-программные решения превращают автомобиль в подключённое к сети Интернет устройство. Специалисты «Лаборатории умного вождения» оказывают адаптированный под каждого клиента набор услуг – от круглосуточного мониторинга состояния автомобиля и защиты от угона до анализа эксплуатационных параметров, контроля расходов и оценки безопасности вождения. Страховым компаниям решения «Лаборатории умного вождения» помогают провести селекцию страхового портфеля и сформировать индивидуальные страховые тарифы для клиентов. Автопроизводителям и автопаркам – внедрить инновационные подходы в бизнесе.

Моторс - официальный дилер LADA в г. Краснодар (Краснодарский край)

Центр-Моторс — официальный дилер LADA в Краснодарском крае и республике Адыгея

Мы продаем все модели и комплектации LADA, обслуживаем по гарантии и в послегарантийный срок, выполняем работы по полному сопровождению жизненного цикла автомобиля.

 

Народная марка

 

LADA — российский бренд, известный во всем мире. В течение 50 лет ПАО «АВТОВАЗ» подтверждает и развивает успех моделей, выпускаемых с конвейеров знаменитого предприятия. Благодаря регулярной модернизации, проводимой производителем, автомобили LADA соответствуют современным мировым требованиям к безопасности, техническому оснащению, комфорту.

 

Проходимые кроссоверы, мощные внедорожники, надежные универсалы, изящные седаны курсируют по дорогам всех континентов. Несмотря на удаленность, высокий температурный и климатический разрыв, сложность маршрутов и разнообразие выполняемых задач, они добросовестно справляются с возложенными на них обязанностями.

 

Услуги Центр-Моторс

 

Для удобства будущих владельцев LADA в дилерских центрах предусмотрены вспомогательные услуги:

 

  • Тест-драйв. Оцените технические возможности выбранного автомобиля. В городе и на бездорожье.
  • Автокредитование LADA Finance. Партнерские программы с ведущими финансовыми компаниями, банками. Эксклюзивные предложения.
  • Trade in. Обмен подержанного автомобиля любой марки на новую LADA.
  • Утилизация. Снимем с вас проблему переработки отслужившего транспортного средства.

 

Мы ценим ваше время, поэтому создали специальные онлайн-формы для записи на все услуги.

 

Центр-Моторс — качественное обслуживание клиентов

 

Профессиональная предпродажная консультация. Наши специалисты знают LADA до последнего винтика, помогут определиться с выбором модели и комплектации, подберут пакет услуг и опций. Лично и по телефону.

 

Скорость оформления сделки и/или технического обслуживания. В наших комфортабельных офисах время пролетает незаметно. И, тем не менее, мы не затягиваем работы, быстро комплектуем документы, в оптимальные сроки проводим диагностику и ТО.

 

Постпродажная поддержка. Вы всегда получите помощь специалиста. Если возник вопрос или столкнулись с проблемой:

 

  • Обратитесь в дилерский центер Центр-Моторс, работаем ежедневно с 8.00 до 20.00

                  г. Краснодар, ул. Дзержинского 124, (2,2км от РКЦ Красная Площадь)

 

В дилерском центре Центр-Моторс вы встретите профессиональную поддержку, серьезный подход к делу, внимание надежных специалистов. Приобретайте прогрессивные LADA в компании Центр-Моторс!

 

LADA — автомобили, проверенные временем и расстояниями!

ЛАДА ЙОЗЕФ — информация на портале Энциклопедия Всемирная история

/ Ориг.: Чеш. Josef Lada

Чешский художник, иллюстратор, сценограф и писатель.

Ранние годы и становление

Родился 17 декабря 1887 г. в чешском селе Грусице в 40 км от Праги. Был четвертым ребенком в семье сапожника Йозефа Лады и его жены Алжбеты. В возрасте 6 месяцев будущий художник напоролся на отцовский сапожный нож и навсегда ослеп на правый глаз. Во многом это увечье повлияло на его художественное видение и графический стиль, в которых отсутствовали пространственное видение и перспектива. Несмотря на то, что семья жила достаточно бедно, Лада всегда вспоминал свои детские годы как самые счастливые в жизни. Во многих его рисунках и иллюстрациях нашли отражение мотивы деревенской жизни из его детских воспоминаний. Его мать была отличной рассказчицей сказок. Этот талант от нее унаследовал и сын, ставший автором целого ряда книг для детей. Любовь к рисованию проявилась у Лады с ранних лет. Из-за отсутствия бумаги, маленький Йозеф рисовал на полях газет, на кухонном столе, на любом обрывке бумаги, изображал избы, дом, костел, а потом и всю деревню. Позже он вспоминал, что первыми цветными картинками, увиденными им, были игральные карты, запомнившиеся на всю жизнь.

В 1901 г. Лада отправился в Прагу, чтобы стать подмастерьем у мастера по оформлению комнат и театральных декораций. Затем он устроился на работу учеником переплетчика, где смог изучить книжное оформление, копировал иллюстрации из книг и различных, в  том числе иностранных журналов. В возрасте 17 лет Йозеф Лада впервые принес свои работы в редакцию журнала «Май», и они были опубликованы. С тех пор он часто публиковал свои иллюстрации в журналах преимущественно юмористического и сатирического характера. В 1904 г. он был зачислен на вечерние курсы рисования при художественно-промышленном училище в Праге, однако вынужден был бросить занятия в 1907 г. из-за отсутствия средств. Покинув переплетную мастерскую, он полностью посвятил себя иллюстрации. С 1908 г. его работы публиковались  и за пределами Чехии: в венском «Мушкете», туринском «Паскуино» и др. Иллюстрации Лады постоянно публиковали такие чешские издания как «Шванда дудак», «Весела Прага», «Рашпиль», «Неруда», «Светилна» и др.

В 1909 г. Лада встал у истоков нового сатирического журнала «Карикатуры»: был редактором, иллюстратором и оформителем. В журнале публиковали свои сочинения чешские писатели, такие как Франя Шрамек, Ярослав Гашек и др. Именно благодаря «Карикатурам» произошло знакомство будущего автора Швейка с Ладой.

В дальнейшем Лада постоянно работал над отдельными юмористическими рисунками и целыми сериями в таких изданиях как «Ческе слово», «Лидовы новины», а также вплоть до Второй мировой войны продолжал активно сотрудничать с целым рядом юмористических чешских журналов. В 1920-е гг. графический стиль Лады окончательно сформировался, стал узнаваем своей лаконичностью, простотой, четким контуром и неповторимым юмором. Лада работал в плоскостной манере, без светотеневой проработки фигур.

Дальнейшее творчество

Йозеф Лада был замечательным иллюстратором детских книг. Первой его работой в этой области стали рисунки для сказки «О Гонзичке и златовласой Изоле» (1906), получившие хорошие отзывы со стороны критиков. Его оригинальный стиль и яркие рисунки выгодно выделялись на фоне детской иллюстрации того времени. В 1911 г. вышла его первая собственная детская книга «Моя азбука», еще при жизни художника выдержавшая 10 изданий. Лада стал автором множества детских книг, как для малышей, так и для более взрослых детей: «Каламайка», «Волчья свадьба», «Побасенки нашего Кадла» и мн. др. Он также издавал детские книги собственного сочинения: серия книг о коте Микеше, сборник «Озорные сказки», рассказ «Страшилища и водяные» и др.

Взрослым Лада известен прежде всего как иллюстратор «Похождений бравого солдата Швейка» Ярослава Гашека. До этой работы, прославившей его на весь мир, Лада успел оформить обложки книг Франи Шрамека «Патрули» (1909), Эмануиля Шкатулы «Война на Балканах» (1913), Эмиля Шпатного «Чешский антимилитаризм» (1922), Карела Вика «Поповская курица» (1919) и мн. др. В 1921 г. Гашек обратился к Ладе с просьбой нарисовать обложку для романа. За сравнительно короткое время (1921-1924 гг.) Лада создал огромную (540 рисунка) серию иллюстраций для «Похождений бравого солдата Швейка». В них сохранен уже выработанный стиль Лады: предельно выразительная линия, очерчивающая фигуры, персонажи напоминают кукол-марионеток. Лаконичность иллюстраций Лады в чем-то напоминает народные лубочные картинки.

В послевоенные годы Лада обратился в новой большой теме – иллюстрированию произведений чешского классика Карела Гавличека Боровского. Лада создал рисунки к сатирическим поэмам «Крещение Святого Владимира» (1946), «Король Лавра», «Тирольские элегии» (обе 1947), книге эпиграмм Боровского (1949) и его стихам (1953).

В 1947 г. Йозефу Ладе было присуждено звание народного художника Чехословацкой республики.

Кроме того, Йозеф Лада проявил себя и в качестве театрального художника: в  1930 г. оформил постановку пьесы «Волынщик из Стракониц» К. Тыла, создавал эскизы декораций и костюмов для пьес Национального театра («Проданная невеста» Б. Сметаны, опера «В стужу» В. Блодки, «Живописная идея» О. Зихи).

18 июня 1923 г. Йозеф Лада женился на Анне Будейицке, вскоре у них родились две дочери: Алена и Ева. Алена пошла по стопам отца, став художницей и иллюстратором, она также выпустила книгу воспоминаний «Мой папа Йозеф Лада». Судьба Евы сложилась трагически. Одаренная пианистка, совсем юная, в годы войны она попала под бомбежку в Праге и погибла в феврале 1945 г. Ее матери не стало спустя 6 лет после этого.

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) - Общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений. Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определенного критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0.2 мкм). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансной передачи энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специализированные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии - это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя флуорофор донора в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему хромофору акцептора без излучения за счет дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, - это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем эффекты растворителя на коротких расстояниях, а диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая в первую очередь зависит от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредовано излучением фотонов и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора. Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансной передачи энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофоров разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В экспериментах этого типа степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутации этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых помечен BFP (донор), а другой - GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцептора (GFP) флуоресценции.

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, микроскопической оптики и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к изучению взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии - это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация - волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их. Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор приблизительно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) - критическое значение Фёрстера. расстояние , τ (D) - время жизни донора в отсутствие акцептора, а r - расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера - это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

κ

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат - коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) - интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) - 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 - (τDA / τD)

, где τ (DA) - время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) - время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET
Донор Акцептор Расстояние Ферстера (нанометры)
Триптофан Дансил 2. 1
ИАЭДАНЫ (1) ДДПМ (2) 2,5 - 2,9
BFP DsRFP 3,1 - 3,3
Дансил FITC 3,3 - 4,1
Дансил Октадецилродамин 4.3
CFP GFP 4.7 - 4,9
CF (3) Техасский красный 5.1
Флуоресцеин Тетраметилродамин 4,9 - 5,5
Cy3 Cy5 > 5,0
GFP YFP 5,5 - 5,7
BODIPY FL (4) BODIPY FL (4) 5.7
Родамин 6G Малахитовый зеленый 6.1
FITC Эозин тиосемикарбазид 6,1 - 6,4
B-фикоэритрин Cy5 7. 2
Cy5 Cy5.5 > 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора посредством вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации κ в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, а то и невозможно определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и дифракции рентгеновских лучей в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Ферстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близкими расстояниями донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ - в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением: 2 = (cos θT - 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ - 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) - угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) - это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ - угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение знания критического расстояния Фёрстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (ов) визуализации, но практически любой прямой или инвертированный микроскоп можно дооснастить для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть объединены с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения. Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогеновой лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной приставки для сканирования в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

  • Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
  • Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
  • Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
  • Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
  • Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
  • Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
  • Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительный срок службы, чтобы произошла резонансная передача энергии.
  • Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
  • При использовании методов маркировки антител биологическая активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами, не должна изменяться. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
  • Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы. Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть присоединены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
  • Живые клетки, помеченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставило значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух значений: I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между донорно-акцепторными парами и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным, флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны в пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET. Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может происходить самотушение, что влияет на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой. В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения донорной эмиссии измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод коррекции обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания). Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением , которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они записываются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора - это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) - начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) - интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t . Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донора и акцептора может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут иметь различное время жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( в импульсном режиме , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения. Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор. Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенным применением флуоресцентного резонансного переноса энергии является измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich - Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Joseph R. Lakowicz - Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон - Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Ист. Поль Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Определение ладов, выполненное Мерриам-Вебстером

\ ˈFret \

переходный глагол

: есть или грызть : ржавчина также : драка Кислота протерла металл. б : руб., Натереть Ремень сбруи составлял гр. Лошади.

c : получить, стирая вещество поток fretted канал

2 : вызвать эмоциональное напряжение : vex не беспокойся обо мне - Дж.К. Поуис 3 : передать (время) в фреттинг бедный игрок, который расхаживает и раздражает свой час на сцене - Уильям Шекспир

непереходный глагол

: съесть что-нибудь

б : воздействовать на что-либо, как если бы грызть или кусать : решетку … настойчивый голос раздражал ему на нервы - Грэм Грин б : натереть Его спина, где натерли ремни безопасности, заболела.

: раздражаться или беспокоиться беспокоит высокую стоимость содержания своих семей - Вэнс Паккард

б проточной воды : взволноваться ручей , бьющий по скалам

: действие истирания : эрозии

б : изношенное или размытое место

переходный глагол

: для украшения чересстрочного рисунка

б : для формирования узора на

2 : для украшения с помощью тисненых или перфорированных резных узоров

1 : орнаментальная сеть особенно : средневековая металлическая или украшенная драгоценностями сетка для женского головного убора.

2 : орнамент или орнаментальное произведение, часто рельефное, состоящее из небольших прямых полос, пересекающихся друг с другом под прямым или косым углом.

: один из ряда выступов, закрепленных на грифе струнного музыкального инструмента (например, гитары).

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET), визуализация локализации белков живых клеток

J Cell Biol.3 марта 2003 г .; 160 (5): 629–633.

W.M. Кек Центр клеточной визуализации, факультеты биологии и биомедицинской инженерии, Университет Вирджинии, Шарлоттсвилль, Вирджиния 22904

Адресная переписка Аммаси Периасами, доктору философии, директору центра, W.M. Кек Центр клеточной визуализации, Департамент биологии, Гилмер Холл (064), Университет Вирджинии, Шарлоттсвилль, Вирджиния 22904. Тел .: (434) 243-7602 / (434) 982-4869. Факс: (434) 982-5210. Электронная почта: [email protected]

Поступило 24 октября 2002 г .; Пересмотрено 21 января 2003 г .; Принята к печати 21 января 2003 г.

Авторские права © 2003, The Rockefeller University Press Эта статья распространяется на условиях лицензии Attribution-Noncommercial-Share Alike-No Mirror Sites в течение первых шести месяцев после даты публикации (см. Http://www.rupress.org/terms ). Через шесть месяцев он становится доступным по лицензии Creative Commons License (Attribution – Noncommercial – Share Alike 4.0 Unported License, как описано на http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/).Эта статья была процитирована. другими статьями в PMC.

Abstract

Современные достижения в области флуоресцентной микроскопии в сочетании с разработкой новых флуоресцентных зондов делают флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) мощным методом изучения молекулярных взаимодействий внутри живых клеток с улучшенным пространственным (ангстрем) и временным (наносекундным) разрешением. , диапазон расстояний и чувствительность, а также более широкий спектр биологических приложений.

Ключевые слова: FRET-микроскопия; анализ данных; камелеоны; димеризация; Анализ FRET

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) * - это физический процесс, зависящий от расстояния, при котором энергия безызлучательно передается от возбужденного молекулярного флуорофора (донора) к другому флуорофору (акцептору) посредством межмолекулярного дальнодействия. диполь-дипольное взаимодействие.FRET может быть точным измерением близости молекул на расстояниях Ангстрема (10–100 Å) и очень эффективным, если донор и акцептор расположены в пределах радиуса Ферстера (расстояние, на котором половина энергии возбуждения донора передается акцептору, обычно 3–6 нм). Эффективность FRET зависит от обратной шестой степени межмолекулярного разделения (Förster, 1965; Clegg, 1996; Lakowicz, 1999), что делает его чувствительным методом для исследования множества биологических явлений, которые вызывают изменения в молекулярной близости (dos Remedios et al. al., 1987). Технологические достижения в визуализации с помощью световой микроскопии в сочетании с доступностью генетически кодируемых флуоресцентных белков обеспечивают инструменты, необходимые для получения пространственного и временного распределения белковых ассоциаций внутри живых клеток (Heim and Tsien, 1996; Day, 1998; Elangovan et al., 2002, 2003).

Широко используемые донорные и акцепторные флуорофоры для исследований FRET происходят из класса аутофлуоресцентных белков, называемых GFP. Спектроскопические свойства, которые тщательно учитываются при выборе GFP в качестве рабочих пар FRET, включают достаточное разделение спектров возбуждения для селективной стимуляции донорного GFP, перекрытие (> 30%) между спектром излучения донора и спектром возбуждения акцептора для получить эффективный перенос энергии и разумное разделение в спектрах излучения между донорными и акцепторными GFP, чтобы позволить независимое измерение флуоресценции каждого флуорофора (Pollok and Heim, 1999).Основанные на GFP методы визуализации FRET сыграли важную роль в определении компартментализации и функциональной организации живых клеток и для отслеживания движения белков внутри клеток (Hanson and Kohler, 2001).

В этой статье мы даем краткое описание методов микроскопической визуализации FRET и анализа данных. Кроме того, обсуждаются важные биологические применения FRET-микроскопии, такие как исследования взаимодействия белков, передача сигналов Ca 2+ , исследования нуклеиновых кислот, характеристика экспрессии генов и анализы ПЦР в реальном времени.

Доступны дополнительные материалы

Более подробная техническая информация о различных методах визуализации FRET на основе интенсивности и времени жизни флуоресценции доступна в Интернете по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200210140/DC1. Также включено обсуждение успехов других методов FRET-микроскопии.

Визуализирующая микроскопия FRET

В то время как световая микроскопия положила начало нашему пониманию клеточной структуры и связанной с ней функции, молекулярно-биологические исследования за последние несколько десятилетий показали, что клеточные события, такие как передача сигнала и транскрипция генов, требуют сборки белков в определенные высокомолекулярные комплексы.Традиционные биофизические или биохимические методы не обеспечивали прямого доступа к взаимодействиям этих белковых партнеров в их естественной среде. Впоследствии были разработаны методы визуализации на основе интенсивности с применением метода FRET-микроскопии (широкопольного, конфокального и многофотонного [MP]), что облегчило изучение этих взаимодействий внутри интактных живых клеток (Periasamy, 2001). Новые технологии визуализации в сочетании с разработкой новых генетически закодированных флуоресцентных меток и датчиков и растущими возможностями компьютерного программного обеспечения для получения и анализа изображений позволили проводить более сложные исследования функций и процессов белков, от экспрессии генов до каскадов вторичных мессенджеров и межклеточного взаимодействия. сигнализация (Roessel and Brand, 2002).

FRET-микроскопия основана на способности улавливать флуоресцентные сигналы от взаимодействий меченых молекул в отдельных живых или фиксированных клетках. Если происходит FRET, сигнал донорного канала будет подавлен, а сигнал акцепторного канала будет сенсибилизирован или увеличен (Herman, 1998). С помощью микроскопии FRET можно увидеть не только совместную локализацию меченных донорами и акцепторами зондов в пределах ~ 0,09 мкм 2 , но и проверить молекулярные ассоциации на близких расстояниях.

Существует несколько методов FRET-микроскопии, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.Они используются для различных биологических применений, включая исследования структуры органелл, конъюгированных антител, цитохимической идентификации и окислительного метаболизма (www.cyto.purdue.edu). Широкопольная микроскопия - самый простой и широко используемый метод. Он используется для количественного сравнения клеточных компартментов и покадровых исследований подвижности клеток, внутриклеточной механики и движения молекул (www.api.com). Например, новые флуоресцентные индикаторы позволили измерять сигналы Ca 2+ в цитозоле и органеллах, которые часто чрезвычайно локализованы (Miyawaki et al., 1997) и неразрушающей визуализации динамической активности протеинтирозинкиназы в отдельных живых клетках (Ting et al., 2001). Однако широкопольная микроскопия имеет серьезный недостаток, связанный с генерацией сигналов вне фокуса. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и микроскопия MP-FRET обеспечивают преимущество исключения не в фокусе информации. Они также позволяют локализовать ассоциации, возникающие внутри клетки, в трех измерениях. Конфокальное изображение FRET () с улучшенным разрешением по горизонтали дает большой объем спектральной информации с рядом преимуществ по сравнению с широкопольным изображением, включая регулируемую глубину резкости и возможность собирать последовательные оптические срезы из толстых образцов.Благодаря своему нанометровому разрешению по глубине и ненавязчивости конфокальный FRET обеспечивает новый подход к измерению вязкоупругости и биохимических реакций живых клеток, а также к мониторингу движения клеточной мембраны в естественной среде в реальном времени (неопубликованные данные). Однако конфокальная микроскопия ограничивается стандартными лазерными линиями определенной длины волны. Микроскопия MP-FRET преодолевает это ограничение за счет использования настраиваемого лазера (диапазон 700–1000 нм), позволяющего возбуждать широкий спектр флуорофоров с более высоким аксиальным разрешением, большим проникновением образца, уменьшенным фотообесцвечиванием маркерных красителей и повышением жизнеспособности клеток.Эти преимущества позволяют проводить исследования на толстых образцах живых тканей, которые в противном случае были бы невозможны с помощью обычных методов. Однако все эти основанные на интенсивности методы FRET требуют обработки программного обеспечения для удаления нежелательных сквозных компонентов в изображении FRET (). .

Конфокальный анализ FRET демонстрирует, что интегрины индуцируют локальное связывание Rac с эффектором. Клетки NIH-3T3 были микроинъектированы кДНК, кодирующей указанные слитые белки GFP-V12-Rac, а затем белком Alexa-PBD (Pozo et al., 2002). Показаны изображения донора (A), нескорректированного FRET (B) и скорректированного FRET (C). На цветовой шкале красный цвет представляет высокий сигнал FRET, а синий - низкий сигнал.

Локализация белков CFP– и YFP – C / EBP α , экспрессируемых в живых клетках GHFT1-5 гипофиза мыши, исследовали с помощью микроскопии MP-FRET от Bio-Rad Laboratories. Донор (A), нескорректированный FRET (B) и обработанный FRET (C) изображения и их соответствующие гистограммы (D, E и F), представляющие мощность сигнала выбранного белка (Elangovan et al., 2003).

Другие методы визуализации FRET.

Временное разрешение методов визуализации может быть достигнуто с помощью метода визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM). Этот метод отслеживает локальные изменения времени жизни флуоресценции зонда и дает огромное преимущество для визуализации динамических событий в живых клетках. В сочетании с FRET этот подход обеспечивает прямые доказательства физических взаимодействий между двумя или более белками с очень высоким пространственным и временным разрешением (Bastiaens and Squire, 1999; Elangovan et al., 2002). Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) (www.probes.com), в которой спонтанные флуктуации интенсивности флуоресценции измеряются в микроскопическом объеме обнаружения, значительно увеличила полезность и объем FRET. FRAP, основанный на принципе наблюдения за скоростью восстановления флуоресценции из-за движения флуоресцентного маркера в область мембраны, широко используется для оценки структуры биологических мембран и измерения латеральной диффузии различных мембран или цитоплазм. составляющие.Связанный с этим метод, потеря флуоресценции при фотообесцвечивании (FLIP), может выявить, происходит ли поток между двумя отделениями или нет. FRAP и FLIP ценны для изучения переноса Golgi / ER в животных клетках (Cole et al., 1996). С развитием новых модальностей FRET, таких как гомотрансфер или миграция энергии FRET, фотохромный FRET (Giordano et al., 2002), биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) (www.lifesciences.perkinelmer.com) и новый класс люминофоров, Будущее FRET, называемого длинноволновыми люминофорами с большим сроком службы и высоким квантовым выходом, светлое.Более конкретно, будущие биологические применения микроскопии визуализации FRET могут включать клеточные события, связанные со специфическими молекулярными процессами передачи сигналов, и одновременное наблюдение серии обратимых молекулярных процессов в живых клетках (Truong and Ikura, 2001).

Анализ данных FRET

Визуализирующая микроскопия FRET на основе интенсивности имеет ряд недостатков, включая автофлуоресценцию, шум детектора, оптический шум и фотообесцвечивание. Кроме того, серьезной проблемой является просачивание спектра (SBT) или вклады флуоресцентного излучения доноров и акцепторов в канал FRET.Из-за этих эффектов наблюдаемый сигнал FRET выше, чем фактический сигнал. Чтобы исправить эти проблемы, были разработаны различные методы анализа данных FRET для широкопольной микроскопии (Gordon et al., 1998; Kraynov et al., 2000; Xia and Liu, 2001). Эти методы корректируют SBT и зависимость FRET от концентраций доноров и акцепторов.

Недавно был разработан новый алгоритм, который устраняет проблемы SBT как донора, так и акцептора и корректирует вариацию уровня экспрессии флуорофора для всех методов FRET на основе интенсивности (широкое поле, конфокальный и MP) для расчета эффективности FRET (в процентах ) и оцените расстояние (в ангстремах) между молекулами донора и акцептора в ячейке с двойной меткой.Корректировки уровня экспрессии SBT и флуорофора включены в математические расчеты (Elangovan et al., 2003). На основе собранных данных сквозной компонент оценивается на основе отдельных образцов донора и акцептора, а затем удаляется из данных FRET, пиксель за пикселем, чтобы получить истинный (или точный) сигнал FRET ().

Приложения FRET в клеточной биологии

Визуализация FRET с использованием спектральных мутантов GFP дает возможность локализовать и контролировать связывание ионов и молекулярные белок-белковые взаимодействия в живых клетках.Например, микроскопия FRET с парой FRET CFP / YFP позволяет обнаруживать прямые межмолекулярные взаимодействия интегрина in vivo. Интегрины являются важными трансмембранными рецепторными белками, участвующими в передаче сигналов и адгезии клеток. Исследования активации и локализации Rac на основе FRET показали, что интегрины индуцируют локальное связывание Rac с эффектором, направляя Rac к мембранам и отделяя его от Rho-GDI (ингибиторов диссоциации гуаниновых нуклеотидов), а также то, что, несмотря на его однородное распределение в клетке конститутивно активный Rac избирательно взаимодействует с эффекторами в определенных областях края клетки (Pozo et al., 2002) ().

Начало и прекращение передачи сигналов Ca 2+ в определенных клеточных компартментах, таких как цитоплазма, ядро ​​или эндоплазматический ретикулум, можно наблюдать, измеряя изменение соотношения интенсивностей флуоресценции акцепторных и донорных молекул в живых клетках (Truong и др., 2001). Cameleons, класс флуоресцентных индикаторов для Ca 2+ на основе GFP и кальмодулина (CAM), являются полезными инструментами для измерения концентраций свободного Ca 2+ в живых клетках.Традиционный желтый камелеон состоит из слияния CFP, CAM, CAM-связывающего пептида киназы легкой цепи миозина (MLCKp) и YFP. При увеличении количества свободного Ca 2+ в растворе CAM-модуль камелеона связывает Ca 2+ и оборачивается вокруг слитого MLCKp. Это конформационное изменение уменьшает расстояние между CFP и YFP. Поскольку FRET зависит как от близости донорных и акцепторных флуорофоров, так и от ориентации их относительных диполей, взаимодействие камелеонов с Ca 2+ приводит к изменениям в степени FRET между CFP и YFP.После калибровки ответа FRET на известные концентрации Ca 2+ , степень FRET in vivo теоретически может отражать абсолютные уровни Ca 2+ , присутствующие в клеточных компартментах.

Помимо внутриклеточного ионного восприятия, конструкции FRET использовались для исследования последующих событий передачи сигналов второго мессенджера (Adams et al., 1991). Нацеленная на сигнальный путь цАМФ, была разработана сенсорная конструкция, в которой индуцируемый киназой домен белка, связывающего цАМФ-чувствительный элемент, образует линкер между синим флуоресцентным белком и GFP.ЦАМФ-индуцированное ПКА-зависимое фосфорилирование, как известно, вызывает конформационные изменения в индуцируемом киназой домене, а эффективность FRET изменяется в ответ на передачу сигналов цАМФ.

FRET устанавливает возможность изучения в локализованном пространственном масштабе взаимодействий между парой рецептор-лиганд, димеризации индивидуальных рецепторов, а также трансбислойного распределения флуоресцентных аналогов липидов и опосредованного белками переноса липидов между везикулами. Изменения в эффективности FRET, вызванные жирными кислотами, фосфолипидами и холестерином, привели к идентификации дискретных участков связывания липидов на мембраносвязанном белке никотинового рецептора ацетилхолина (www.kenes.com/cholinergic). FRET используется для обнаружения димеризации рецептора EGF (EGFR) и его конформационного состояния (Gadella and Jovin, 1995). Флуоресцентно меченным молекулам EGF с донором флуоресцеина и акцептором родамина позволяли связывать EGFR, присутствующий на клетках. Степень олигомеризации рецепторов контролировали по пространственно разрешенной эффективности FRET как функции соотношения донор / акцептор и условий обработки. Увеличение средней эффективности FRET указывает на минимальную димеризацию рецептора для субпопуляции рецепторов с высоким сродством.Эти результаты доказали, что связывание EGF приводит к быстрой и зависящей от температуры микрокластеризации EGFR, который присутствует в предимеризованном или олигомеризованном состоянии.

FRET также используется для изучения структуры, конформации, гибридизации и автоматического секвенирования нуклеиновых кислот. Хромосомный FISH, основанный на гибридизации фрагмента нуклеиновой кислоты с его комплементом, стал чрезвычайно важным для картирования генов, идентификации мутаций, клинической диагностики и исследований хромосомной и ядерной архитектуры.Диагностический анализ гомогенной ДНК, основанный на матрично-направленном удлинении праймера, обнаруженном FRET, названный матричным анализом включения терминатора красителя, был разработан для обнаружения мутаций и высокопроизводительного анализа генома (Chen et al., 1997).

Более свежий подход к характеристике экспрессии генов включает использование «флуоресцентного таймера», мутанта флуоресцентного белка dsRed, который со временем меняет цвет с зеленого на красный. Зеленая флуоресценция указывает на недавно транслированный белок, который в течение нескольких часов подвергается кислородозависимой автокаталитической реакции с генерацией красной флуоресценции, обозначающей созревший белок.Поскольку белок-таймер со временем переключает флуоресценцию, его можно использовать в качестве таймера для экспрессии гена. Таким образом, ткань показывает историю производства своего флуоресцентного таймера по соотношению зеленой и красной флуоресценции; ткани, которые недавно начали экспрессию генов, выглядят зелеными, ткани с непрерывной экспрессией - от желтых до оранжевых, а те, которые прекратили экспрессию - полностью красными.

FRET также находит широкое применение в анализах слияния мембран и ПЦР в реальном времени. В анализах смешения липидов, основанных на передаче энергии NBD-родамин (Struck et al., 1981), мембраны, меченные комбинацией липидных зондов донора и акцептора FRET, смешивают с немечеными мембранами. FRET уменьшается, когда среднее пространственное разделение зондов увеличивается при слиянии меченых мембран с немечеными мембранами. В ПЦР в реальном времени количество испускаемой флуоресценции в каждом цикле отслеживается как индикатор продукции ампликона. Флуоресцентный мониторинг ПЦР для обнаружения и количественной оценки стал стандартным методом со многими приложениями, включая анализ экспрессии и обнаружение патогенов.

FRET-иммуноанализы, содержащие фосфопептид, меченный на конце Cy5 NH 2 , который распознается первичным мышиным антителом против фосфотирозина, за которым следует вторичное антитело, меченное Cy3, полезны для измерения специфических взаимодействий антитело-антиген. FRET возникает, когда компоненты последовательно связываются вместе, и возбуждение на длинах волн Cy3 дает излучение на длинах волн Cy5. Нарушение взаимодействия между фосфопептидом и первичным антителом приведет к снижению наблюдаемого сигнала FRET.FRET также используется при разработке и синтезе флюорогенных ферментных субстратов на основе FRET, полезных для мониторинга ферментативной активности.

Заключение

Биология, визуализация и спектроскопия недавно были объединены, чтобы предоставить мощные инструменты для исследований и клинических приложений. Методы FRET и флуоресцентные реагенты, такие как GFP, которые широко используются для исследования наличия и активности генов, клеточных компонентов, а также метаболических или сигнальных путей, могут стать более мощными и гибкими при использовании инструментов мультиспектральной визуализации.Спектральная визуализация позволила улучшить методы хромосомного анализа и генотипирования за счет простого и точного обнаружения хромосомных перестроек, связанных с раком и генетическими аномалиями. Методы оптической биопсии используют спектроскопическую информацию, присутствующую во внутренних или экзогенных хромофорах и флуорофорах, для дифференциации опухолей и дисплазий от нормальных тканей. Также расширяются возможности применения FRET-визуализации тканей. Благодаря последним достижениям в области флуоресцентных датчиков, приборов и методологий FRET обязательно произведет революцию в научных исследованиях в ближайшем будущем.

Дополнительные материалы

[Указатель дополнительных материалов]

Благодарности

Мы хотим поблагодарить докторов наук. Ричард Дэй и Мартин Шварц за полезные обсуждения. Мы благодарим Колтен Ноукс и г-жу Е Чен за их квалифицированную помощь.

Работа поддержана Фондом W.M. Фонд Кека.

Примечания

Онлайн-версия этой статьи включает дополнительные материалы.

Сноски

* Сокращения, используемые в этой статье: САМ, кальмодулин; EGFR, рецептор EGF; FRET - резонансный перенос энергии флуоресценции; МП, многофотонный; SBT, спектральное просвечивание.

Ссылки

  • Adams, S.R., A.T. Арутюнян, Ю.Дж. Бюхлер, С.С. Тейлор, Р.Ю. Цзянь. 1991. Визуализация соотношения флуоресценции циклического АМФ в отдельных клетках. Природа. 349: 694–697. [PubMed] [Google Scholar]
  • Bastiaens, P.I., and A. Squire. 1999. Визуализирующая микроскопия времени жизни флуоресценции: пространственное разрешение биохимических процессов в клетке. Trends Cell Biol. 9: 48–52. [PubMed] [Google Scholar]
  • Чен, Х., Б. Зенбауэр, А. Гнирке, П.Ю. Квок. 1997 г.Детектирование переноса энергии флуоресценции как метод диагностики гомогенной ДНК. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 94: 10756–10761. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Clegg, R.M. 1996. Флуоресцентный резонансный перенос энергии. Флуоресцентная спектроскопия и микроскопия. Vol. 137. X.F. Ван и Б. Герман, редакторы. John Wiley & Sons Inc., Нью-Йорк. 179–251.
  • Cole, N.B., C.L. Smith, N. Sciaky, M. Terasaki, M. Edidin и J.L. Schwartz. 1996. Диффузионная подвижность белков Гольджи в мембранах живых клеток.Наука. 273: 797–801. [PubMed] [Google Scholar]
  • Day, R.N. 1998. Визуализация взаимодействий фактора транскрипции Pit-1 в ядре живой клетки с помощью флуоресцентной резонансной микроскопии переноса энергии. Мол. Эндокринол. 12: 1410–1419. [PubMed] [Google Scholar]
  • душ Ремедиос, К.Г., М. Мики и Дж. А. Барден. 1987. Измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии на расстояниях в актине и миозине: критическая оценка. J. Muscle Res. Cell Motil. 8: 97–117. [PubMed] [Google Scholar]
  • Элангован, М., Р. Дэй и А. Периасами. 2002. Наносекундная флуоресцентная резонансная микроскопия с переносом энергии и продолжительностью жизни флуоресценции для локализации белковых взаимодействий в отдельной живой клетке. J. Microsc. 205: 3–14. [PubMed] [Google Scholar]
  • Элангован, М., Х. Вальрабе, Ю. Чен, Р.Н. Дэй, М. Баррозу и А. Периасами. 2003. Характеристика одно- и двухфотонной флуоресцентной микроскопии с резонансным переносом энергии. Методы. 29: 58–73. [PubMed] [Google Scholar]
  • Förster, T.1965. Делокализованное возбуждение и передача возбуждения. Современная квантовая химия. Vol. 3. Синаноглу О., редактор. Academic Press Inc., Нью-Йорк. 93–137.
  • Гаделла, T.W.J., младший, и Т.М. Джовин. 1995. Олигомеризация рецепторов эпидермального фактора роста на клетках A431 изучена с помощью флуоресцентной микроскопии с временным разрешением. Стереохимическая модель активации рецептора тирозинкиназы. J. Cell Biol. 129: 1543–1548. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Giordano, L., T.M.Джовин, М. Ири и Э.А. Ярес-Эриджман. 2002. Дигетероарилэтены как термостабильные фотосопереключаемые акцепторы в фотохромной флуоресцентной резонансной передаче энергии (pcFRET). Варенье. Chem. Soc. 124: 7481–7489. [PubMed] [Google Scholar]
  • Gordon, G.W., G. Berry, X.H. Лян, Б. Левин и Б. Херман. 1998. Количественные измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии с использованием флуоресцентной микроскопии. Биофиз. Дж. 74: 2702–2713. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Hanson, M.R. и R.H. Kohler. 2001. GFP визуализация: методология и применение для исследования клеточной компартментации в растениях. J. Exp. Бот. 52: 529–539. [PubMed] [Google Scholar]
  • Heim, R., and R.Y. Цзянь. 1996. Разработка зеленого флуоресцентного белка для повышения яркости, увеличения длины волны и резонансной передачи энергии флуоресценции. Curr. Биол. 6: 178–182. [PubMed] [Google Scholar]
  • Герман Б. 1998. Флуоресцентная микроскопия. 2-е изд. Springer-Verlag New York Inc., Нью-Йорк. 170 стр.
  • Крайнов В.С., Чемберлен Г.М. Бокоч, М.А.Шварц, С. Слабо, К. Хан. 2000. Визуализация динамики локализованной активации Rac в живых клетках. Наука. 290: 333–337. [PubMed] [Google Scholar]
  • Лакович, Дж. Р. 1999. Принципы флуоресцентной спектроскопии. 2-е изд. Plenum Publishing Corp., Нью-Йорк. 692 с.
  • .
  • Мияваки А., Дж. Ллопис, Р. Хайм, Дж. М. Маккаффери, Дж. А. Адамс, М. Икура и Р.Ю. Цзянь. 1997. Флуоресцентные индикаторы для Ca 2+ на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина.Природа. 388: 882–887. [PubMed] [Google Scholar]
  • Periasamy, A. 2001. Методы клеточной визуализации. Издательство Оксфордского университета, Нью-Йорк. 434 pp.
  • Pollok, B.A., and R. Heim. 1999. Использование GFP в приложениях на основе FRET. Trends Cell Biol. 9: 57–60. [PubMed] [Google Scholar]
  • Посо, M.A.D., W.B. Киоски, Н. Олдерсон, Н. Меллер, К. Хан и М.А.Шварц. 2002. Интегрины регулируют локализованные эффекторные взаимодействия GTP-Rac посредством диссоциации Rho-GDI. Nat. Cell Biol.4: 232–239. [PubMed] [Google Scholar]
  • Roessel, P.V., and A.H. Brand. 2002. Визуализация в будущее: визуализация экспрессии генов и взаимодействия белков с флуоресцентными белками. Nat. Cell Biol. 4: E15 – E20. [PubMed] [Google Scholar]
  • Struck, D.K., D. Hoekstra, and R.E. Пагано. 1981. Использование резонансной передачи энергии для контроля слияния мембран. Биохимия. 20: 4093–4099. [PubMed] [Google Scholar]
  • Труонг, К. и М. Икура. 2001. Использование микроскопии изображений FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий и изменений конформации белков in vivo.Curr. Opin. Struct. Биол. 11: 573–578. [PubMed] [Google Scholar]
  • Truong, K., A. Sawano, H. Mizuno, H. Hama, K. Tong, T.K. Мал, А. Мияваки и М. Икура. 2001. Визуализация in vivo на основе FRET Ca 2+ с помощью новой слитой молекулы кальмодулин-GFP. Nat. Struct. Биол. 8: 1069–1073. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ting, A.Y., K.H. Каин, Р.Л. Клемке, Р.Ю. Цзянь. 2001. Генетически кодируемые флуоресцентные репортеры активности протеинтирозинкиназы в живых клетках.Proc. Natl. Акад. Sci. США. 98: 15003–15008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Ся, З. и Ю. Лю. 2001. Надежное и глобальное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью флуоресцентных микроскопов. Биофиз. Дж. 81: 2395–2402. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Флуоресцентный резонансный перенос энергии FRET — Примечание 1.2 | Thermo Fisher Scientific

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) - это зависящее от расстояния взаимодействие между электронными возбужденными состояниями двух молекул красителя, при котором возбуждение передается от молекулы-донора к молекуле-акцептору без испускания фотона .Эффективность FRET зависит от обратной шестой степени межмолекулярного разделения, что делает его полезным на расстояниях, сопоставимых с размерами биологических макромолекул. Таким образом, FRET - важный метод исследования множества биологических явлений, которые вызывают изменения в молекулярной близости. Когда FRET используется в качестве механизма контраста, совместная локализация белков и других молекул может быть отображена с пространственным разрешением, выходящим за пределы традиционной оптической микроскопии.

Основные условия для FRET

  • Донорные и акцепторные молекулы должны находиться в непосредственной близости (обычно 10–100 Å).
  • Спектр поглощения акцептора должен перекрывать спектр излучения флуоресценции донора ( Рисунок 1 ).
  • Ориентации диполей переходных доноров и акцепторов должны быть примерно параллельны.


Рис. 1.
Схематическое изображение интеграла перекрытия спектров FRET.

Радиус Фёрстера

Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50% (т.е. 50% возбужденных доноров деактивируется FRET), определяется радиусом Ферстера (R 0 ). Величина R 0 зависит от спектральных свойств донорных и акцепторных красителей ( Таблица 1 ):

Таблица 1. Типичные значения R
0 9018 ED4 9018 9018 ED4
Донор Акцептор R 0 (Å)
Флуоресцеин Тетраметилродамин 55
IAEDANS Флуоресцеин 46
44
BODIPY FL BODIPY FL 57
Флуоресцеин QSY 7 и QSY 9 красители 61

9000 Пары донор / акцептор

Избранные приложения FRET

Передача энергии резонанса флуоресценции - обзор

3.1.3.1.2 Флуоресцентная спектроскопия

Общие принципы флуоресцентной спектроскопии здесь не объясняются. Его можно найти в специальных учебниках [48], и его краткое изложение представлено на рис. 3.17.

Рисунок 3.17. Общий принцип флуоресцентной спектроскопии. (A) Представление основных переходов между двумя синглетными состояниями молекулы. На всей остальной части этого рисунка синие и зеленые стрелки (темно-серая и серая стрелка в печатных версиях) представляют собой поглощение света и его излучение флуоресценцией, соответственно.Оранжевая стрелка (светло-серая стрелка в версиях для печати) представляет релаксацию энергии за счет безызлучательных процессов. Для простоты теоретически запрещенный переход в более низкоэнергетическое триплетное состояние «T» не был представлен, но он лежит в основе излучения фосфоресценции. (B) Схематическое изображение флуоресцентного спектрофотометра. (C) Химическая структура и абсорбция (синяя кривая (темно-серая в печатных версиях)) - эмиссионные (зеленая кривая (серая в печатных версиях)) спектры флуоресцеина.

Наиболее распространенными флуоресцентными фрагментами являются органические флуорофоры (кумарины, флуоресцеины, родамины, оксазины и цианины в порядке увеличения длины волны флуоресцентного излучения), хелаты лантаноидов или флуоресцентные наночастицы (см. Главу 6.9).

Два наиболее интересных аспекта для целей этой книги состоят в измерении динамической релаксации светового излучения, позволяющем определять характерные времена жизни флуоресценции, и в определении расстояния между двумя флуорофорами (наложенными на одном или двух различных молекул), используя эффект резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

FRET обычно предназначен для определения расстояния (а также ориентации) между флуоресцентным донором ( D ) и акцептором ( A ). Эффективность безызлучательной передачи энергии между D и A зависит от следующего:

1.

Относительная ориентация D и A , которые рассматриваются как диполи

2.

Степень спектрального перекрытия между спектром излучения флуоресценции D и спектром поглощения A

3.

Расстояние r между D и A

Если спектральное перекрытие между флуоресценцией D и поглощением A равно нулю, передачи энергии не будет, даже если D и A очень близки. Если есть спектральное перекрытие, то передача энергии масштабируется как величина, обратная шестой степени r , что типично для диполь-дипольных взаимодействий между небольшими молекулами (см. Главу 2.1). Эффективность передачи энергии тогда определяется как

(3.34) E = R06R06 + r6

В этом уравнении R 0 является критическим расстоянием, для которого эффективность передачи энергии снижается до 50% от максимальное значение при r = 0.

В теории Ферстера R 0 пропорционально квантовому выходу донора ( ϕ ) и интегралу спектрального перекрытия J между излучениями спектр D и спектр поглощения A :

(3.35) R0 = (8,8 × 10-25) · K2 · ϕ · Jn4

, где K учитывает взаимную ориентацию D и A . n - показатель преломления используемого растворителя.

Перед проведением экспериментов FRET с определенной молекулярной системой необходимы следующие предварительные эксперименты:

1.

Квантовый выход донора должен быть измерен в растворителе, используемом для экспериментов FRET.

2.

Спектры флуоресценции D и спектры поглощения A необходимо измерить при концентрациях, используемых в эксперименте FRET для вычисления интеграла перекрытия J .

Эффективность FRET показана на рис. 3.18 для различных значений R 0 .

Рисунок 3.18. Эффективность передачи энергии резонанса флуоресценции как функция расстояния между D и A для R 0 = 1 (), 2 ((серый в печатных версиях)) и 5 ​​((темно-серый в версии для печати)) нм.

На схемах в верхней части представлены изменения расстояния между D (обозначено звездочкой) и A (обозначено диском) по отношению к конформационному изменению.

Справедливость уравнения. (3.35) был критически протестирован для дансил- (Pro) n -нафтилпептидов, проявляющих конформацию спирали полипролина типа II. Вдоль этой спирали расстояние между донором нафтила и акцептором дансила можно точно регулировать числом пролинов в аминокислотной последовательности [49].

FRET использовался для исследования многих механизмов реакции. Типичным примером является выяснение индуцированного вирусами слияния липидов, межфазного явления, имеющего фундаментальное значение в медицинских науках [50].

Флуоресцентная спектроскопия особенно полезна для исследования взаимодействий между биомакромолекулами, такими как белки, и их партнерами по связыванию. Действительно, взаимодействие может изменить локальную полярность вокруг флуорофора и, следовательно, локальные дипольные моменты. Это вызывает изменение положения либо самого низкого энергетического уровня (самая высокая занятая молекулярная орбиталь), либо / или энергетического уровня молекулярной орбитали возбужденного состояния (например, самая низкая незанятая молекулярная орбиталь) и, следовательно, изменение поглощения спектр, но еще более заметное изменение в спектре излучения.

В качестве примера рассмотрим собственные флуоресцентные аминокислоты в белках. Соответствующие флуоресцентные группы представляют собой боковые цепи триптофана (Trp в трехбуквенном коде аминокислот), тирозина (Tyr) и фенилаланина (phe). Среди этих боковых цепей Trp имеет самый высокий квантовый выход эмиссии. Максимум спектра поглощения расположен при 280 нм, а максимум излучения - при 340 нм в воде. Но этот максимум излучения смещается в сторону более коротких длин волн (синее смещение), если Trp находится в гидрофобной внутренней части белка, и смещается в сторону более высоких длин волн, когда белок разворачивается (см. Главу 2.9).

Интенсивность флуоресценции также можно изменить с помощью процессов гашения. График отношения интенсивности флуоресценции в отсутствие гасителя, F 0 , к интенсивности флуоресценции F в присутствии концентрации гасителя [ Q ] обычно дает прямую линию:

(3,36 ) F0F = 1 + KS · [Q]

Наклон этого так называемого уравнения Штерна – Фольмера дает константу гашения K S , которая напрямую связана со временем жизни флуоресцентной группы в отсутствие тушителя, τ , и бимолекулярной константе скорости процесса тушения, k q , согласно

(3.37) Ks = kq · τ

Экспериментально полученное значение k q часто сравнивают с константой скорости диффузии для бимолекулярного процесса k d = 2,0 × 10 10 л моль -1 с -1 . Когда k q > k d , процесс закалки ограничен диффузией, и процесс закалки является «статическим». Это означает, что существует комплексное образование между флуоресцентной молекулой в основном состоянии и гасителем.Процесс гашения также может быть «динамическим», подразумевая образование комплекса между флуоресцентной молекулой в возбужденном состоянии и гасителем.

Наконец, еще одно интересное применение флуоресцентной спектроскопии состоит в проведении анализов конкурентного связывания. Флуоресцентной молекуле (теперь называемой «рецептором» R ) сначала разрешается взаимодействовать с известной молекулой C ( C для «конкурента»), которая действует как гаситель и, как известно, связывается с известным область рецептора.Затем интересующий лиганд, L , титруют в рецепторном растворе; если интенсивность флуоресценции изменяется, C замещается L , что означает, что L связывается с рецептором в месте, близком к C . Хорошо известными примерами конкурентов флуоресценции альбуминов являются варфарин и ибупрофен, которые действуют как маркеры сайтов для сайта I (расположенного в субдомене IIA альбуминов) и сайта II (расположенного в субдомене IIIA альбуминов), соответственно [51].

Теперь мы сосредоточимся на реализации флуоресцентной спектроскопии на поверхностях.

Интернет-кампус ZEISS Microscopy | FRET-микроскопия со спектральной визуализацией

Введение

Сложная ассоциация между белками и путями передачи сигналов, которые контролируют клеточную функцию, зависит от множества слабых и временных динамических взаимодействий, которые часто трудно или даже невозможно охарактеризовать с помощью традиционной биохимической методологии.Флуоресцентная микроскопия продемонстрировала превосходную чувствительность при обнаружении чрезвычайно низких концентраций меченых биомолекул в очень широких пространственных и временных измерениях. С появлением и разработкой высокоэффективных генетически закодированных флуоресцентных белков, которые могут стабильно экспрессироваться в живых клетках, несколько методов флуоресценции стали мощными инструментами для визуализации динамических взаимодействий между белками in situ и в физиологических условиях. В частности, применение резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) становится все более популярным, чтобы служить в качестве молекулярной линейки при определении межмолекулярных расстояний или для демонстрации того, образуются ли даже молекулярные комплексы.Для конструирования биомолекул, потенциально способных к взаимодействию FRET, можно использовать простые методы молекулярной биологии для слияния кДНК, кодирующей флуоресцентные белки, с белками-мишенями, которые, как предполагается, участвуют. В настоящее время предпочтительными флуоресцентными белками для анализа FRET являются производные GFP медузы Aequorea victoria , имеющие голубую и желтую эмиссию (ECFP и EYFP) в качестве доноров и рецепторов соответственно. Хотя ECFP и EYFP использовались в многочисленных исследованиях FRET, несколько новых и более совершенных вариантов, Cerulean (производное голубого) и Citrine или Venus (желтые производные), оказались очень эффективными в обеспечении расширенного динамического диапазона, необходимого для внимательно следите за чувствительными сигналами FRET.Кроме того, постоянное расширение цветовой палитры флуоресцентных белков предоставляет новых кандидатов в оранжевой, красной и дальней красной области спектра в качестве потенциальных партнеров FRET для существующих голубых, зеленых и желтых белков.

Одним из наиболее полезных приложений FRET в клеточной биологии является метод, который включает слияние двух флуоресцентных белков с концами экологически чувствительного белка или пептида, чтобы действовать как биосенсор определенных клеточных функций.Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение в сообщении о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков, способных к FRET, с биополимерами, которые выполняют важные функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как кальциевая волна. индукция, эффекты передачи циклических нуклеотидов, pH, флуктуации мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. Рисунок 1). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков (в данном случае Cerulean и Venus), связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, датчик демонстрирует очень сильный резонансный перенос энергии, который полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности. Поскольку метод обычно имеет высокий уровень динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами.Принципы резонансной передачи энергии Ферстера (FRET)

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении света флуорофором на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Максимумы (пики) спектральных профилей возбуждения и излучения отделены друг от друга переменной шириной полосы в диапазоне от десятков до сотен нанометров. Маркировка внутриклеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специализированные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. Используя этот метод, молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, оказываются совпадающими (и говорят, что они колокализуются). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна.В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. FRET - это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии (донор ) ко второму флуорофору (акцептор ) в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения FRET могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий.

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который способен передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения флуорофора в возбужденном состоянии как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии (которая не происходит в FRET) требует испускания и последующего повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. . В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью событий, зависящих от растворителя, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, - это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансного переноса энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции (от которой экспериментальная эффективность FRET можно извлечь).Если акцептор является флуоресцентным, он будет излучать фотоны в соответствии со своим характерным спектральным профилем, производя, таким образом, измеримое ратиометрическое изменение сигнала. Большое отношение интенсивности акцептора к донору указывает на высокую эффективность FRET, которая также может быть приписана более короткому расстоянию или более благоприятной ориентации между флуорофорами. Эффективность процесса передачи энергии ( E FRET ) изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора ( r ), как показано в уравнении, представленном ниже.Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорофором, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга. Таким образом, эффективность FRET математически может быть описана как:

E FRET = 1 / [1 + (r / R 0 ) 6 ]

, где R 0 (обычно называемый радиусом Ферстера) представляет собой характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов.В дополнение к требованию близости, эффективная передача энергии требует значительного перекрытия спектров излучения донора и спектров поглощения акцептора (как показано на рисунке 2). Эффективность повышается за счет увеличения квантового выхода донора и / или коэффициента экстинкции акцептора. Например, квантовый выход ECFP составляет 0,40, тогда как квантовый выход Cerulean примерно на 50 процентов больше, что увеличивает эффективность FRET, когда Cerulean заменяется на ECFP в качестве донора FRET.Точно так же коэффициент экстинкции Венеры примерно на 11 процентов выше, чем у EYFP, что делает Венеру лучшим акцептором FRET. В общем, спектральное перекрытие между донором и акцептором должно быть достаточным для обеспечения радиуса Ферстера, который составляет приблизительно 4 нанометра или более. Другим важным параметром, который следует учитывать при выборе флуоресцентных белков в качестве пар FRET, является соответствие относительной скорости созревания. Время, необходимое для созревания хромофора, колеблется от нескольких минут до многих часов, в зависимости от конкретного белка, и может широко варьироваться в пределах других близкородственных вариантов.Измерения FRET будут скомпрометированы в случаях, когда донорский флуоресцентный белок созревает значительно быстрее или медленнее, чем акцептор.

Для оптимизации измерений FRET необходимо учитывать множество других факторов. Одна из основных проблем - относительная яркость донорных и акцепторных флуорофоров. Как правило, из-за ограниченного динамического диапазона большинства микроскопов сопоставимые по яркости флуорофоры дают более удовлетворительные результаты. Значительное несоответствие яркости часто приводит к тому, что сигнал от одного флуорофора насыщает канал детектора, а сигнал от другого (диммера) флуорофора теряется в минимальном уровне шума.Другой часто встречающейся ловушкой является прямое возбуждение акцептора на длине волны, используемой для возбуждения донора, что приводит к избыточной эмиссии акцептора, которая не возникает в результате FRET. Этот артефакт упоминается как акцепторное спектральное просачивание . Кроме того, флуоресцентное излучение донора может просачиваться в канал обнаружения акцептора (известный как донорский спектральный проход ), что также приводит к искусственно завышенным значениям FRET (рис. 2). В связи с тем, что эти источники проступания будут присутствовать практически во всех парах FRET, они неизбежно должны быть устранены во время измерений FRET.Флуоресцентные белки в анализе FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, которые идеально подходят для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки. Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне плазматической мембраны, но эти зонды не могут проникнуть через мембрану и поэтому мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии, комплекс Гольджи. , или эндоплазматический ретикулум.Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время являются одними из лучших кандидатов на флуорофоры для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением. Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от ширины полосы 30-40 нанометров при полной ширине на половине высоты ( FWHM ), характерной для спектральных профилей излучения многих синтетических красителей, во флуоресцентных белках они колеблются от приблизительно 60 нанометров до более 100 нанометров, что часто приводит к значительные области перекрытия при попытке разделить флуоресценцию донора и акцептора.Таким образом, широкие спектральные профили флуоресцентных белков ограничивают количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220–230 аминокислот, свернутый в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (так называемый бета -ствол ; см. Рисунок 3) и состоящий из сильно связанных водородными связями бета -листы, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую остатки, образующие хромофор.Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов, воды и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно заполнена боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET (рис. 3). Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентных белков пептидными остатками (на ограничивающем расстоянии близкого приближения от 2 до 3 нанометров), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET, которую можно получить с флуоресцентными белками, примерно до 40 процентов от теоретическое значение.Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Проблемы, связанные со спектральной шириной полосы и размером, с которыми сталкиваются флуоресцентные белки, также связаны с их высоким сродством к олигомеризации. Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria и его производных димеризоваться при иммобилизации в высоких концентрациях (например, когда связаны с плазматической мембраной).Этот артефакт также наблюдался в мотиве строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных в рифовых кораллах и морских анемонах. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место. После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы.Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природных олигомеров (таких как актин, тубулин и щелевые соединения; см. Рисунок 4). Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локализованная концентрация остается низкой. Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, как описано выше, локальная концентрация белка может стать достаточно высокой, чтобы позволить димеризацию.Это явление может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые часто дают сложные наборы данных, которые иногда скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков медуз в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Клеточный дистресс, ведущий к апоптозу или некрозу, - это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков.Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое происходит при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров, светодиодов и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп. В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы склонны реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку.Флуоресцентные белки обычно не фототоксичны для клеток, отчасти из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки (см. Рисунок 3). При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах. Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.К сожалению, низкие коэффициенты поглощения и квантовые выходы мономерных оранжевых и красных флуоресцентных белков препятствуют их широкому применению в анализе FRET. Возможно, по мере открытия новых вариантов флуоресцентных белков зонды в более длинноволновых цветных областях станут полезными акцепторами FRET для желтых и зеленых доноров.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET и не мешают другим важным биологическим явлениям.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки рифовых кораллов (обсуждаемые выше) имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось о флуоресцентном белке, способном генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, как об эффективном агенте для инактивации определенных белков с помощью хромофорной световой инактивации ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed, способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности ECFP и EYFP показали, что даже через хромофоры, способные генерировать синглетный кислород, эти зонды неэффективны в качестве фотосенсибилизаторов. Однако продолжительное освещение клеток, экспрессирующих любой вариант EGFP, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным показателем возможности фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной покадровой визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, вращающегося диска, многофотонного и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. газоразрядная лампа против лазерной системы. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Первой парой флуоресцентных белков, разработанной для анализа FRET, был синий вариант (EBFP) в сочетании с EGFP, предназначенный для возбуждения источником ультрафиолетового света. К сожалению, относительно плохие фотофизические свойства EBFP, наряду с потенциальной фототоксичностью коротковолнового освещения, сделали эту комбинацию непрактичной. Новые варианты синего флуоресцентного белка могут воскресить эту стратегию спаривания для краткосрочных наблюдений, но им все равно будет мешать потребность в высокоэнергетическом возбуждении, что исключает использование голубых флуоресцентных белков для долгосрочной визуализации.Наиболее эффективной парой флуоресцентных белков FRET остается высокоэффективный вариант ECFP в качестве донора, связанный с высокоэффективным вариантом EYFP в качестве акцептора. Другие пары включают EGFP или производное EYFP в качестве донора для оранжевых и красных вариантов, таких как мономерный Kusabira Orange или mCherry. Среди проблем, связанных с применением оранжевых и красных флуоресцентных белков (все они получены из рифовых кораллов и морских анемонов) в качестве акцепторов FRET, являются длинные хвосты возбуждения, представленные в спектральных профилях поглощения.Во многих случаях спектры поглощения простираются в голубую и зеленую области спектра, что приводит к прямым артефактам возбуждения акцепторов.

Свойства пар флуоресцентных белков для спектральной визуализации FRET

Флуоресцентный
Белок
Пара
Донор
Возбуждение
Максимум
(нм)
Приемник
Излучение
Максимум
(нм)
Донор
Quantum
Выход
Акцептор
Коэффициент экстинкции
Förster
Расстояние
(нм)
Яркость
Коэффициент
EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57 500 4,8 1: 2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83 400 4,9 1: 4
Церулеанско-Венера 440 528 0.62 92 200 5,4 1: 2
MiCy-mKO 472 559 0,90 51 600 5,3 1: 2
TFP1-m Вена 492 528 0.85 92 200 5,1 1: 1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104 000 5,1 1: 4.5
EGFP-mCherry 507 510 0.60 72 000 5,1 2,5: 1
Венера-мЧерри 528 610 0,57 72 000 5,7 3: 1
Venus-tdTomato 528 581 0.57 138 000 5,9 1: 2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41 000 5,2 13: 1
Таблица 1

Недавнее расширение цветовой палитры флуоресцентных белков для создания вариантов, обладающих широким спектром спектральных профилей, в сочетании с возрастающей сложностью конструкции белковых химер (слияния, а также биосенсоры) привело к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые являются потенциально полезно в экспериментах FRET (см. Таблицу 1).Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единую генетически закодированную конструкцию, как кратко обсуждалось выше), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком. Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках.Методы измерения FRET

В связи с тем, что практически все комбинации флуорофоров, используемые для мониторинга FRET, затруднены отдельными и часто уникальными проблемами, которые усложняют их применение для этого метода, для исследователя критически важно полностью понять методологию, в соответствии с которой используется FRET. измеряется. Исследователи должны использовать как можно больше различных методов измерения при проведении пилотных экспериментов с новыми комбинациями FRET с биологическими последствиями.После того, как система была настроена, а результаты согласованы и хорошо поняты, простейшие экспериментальные подходы могут быть использованы для дополнительных измерений. Несмотря на то, что было разработано большое количество методов для измерения FRET, многие из них очень сложны и требуют оборудования, которого нет в большинстве центров микроскопии керна. Наиболее практичные подходы к измерению FRET ограничиваются несколькими методами, которые будут рассмотрены ниже.

Высокая степень спектрального перекрытия между профилями излучения донора и поглощения акцептора, необходимая для FRET, также создает значительный уровень фонового шума, который может существенно мешать обнаружению сигналов FRET.Как обсуждалось ранее, спектральное просвечивание, возможно, является основной проблемой при разделении сигналов FRET для анализа. И донор, и акцептор обычно вносят свой вклад в просачивание, которое может быть обнаружено в канале FRET. Просачивание от донора происходит из-за перекрытия профилей излучения флуоресценции донора и акцептора, которые часто очень широкие (более 100 нанометров) и их трудно разделить. Напротив, просачивание из акцептора происходит в результате прямого возбуждения акцепторных флуорофоров освещением, которое используется для возбуждения донора и образования FRET.Большое количество других источников шума также может испортить измеряемый сигнал FRET. К ним относятся автофлуоресценция, детектор микроскопа и оптический шум, а также вариации спектральной чувствительности в донорных и акцепторных каналах. В результате наиболее полезный подход к измерению точных сигналов FRET требует применения методологии, которая может либо избежать, либо успешно удалить загрязняющие фоновые сигналы.

Потеря сигнала

- хотя можно в значительной степени избежать с помощью методов FRET, таких как фотообесцвечивание акцептора (также обычно называемое декеннингом донора ; см. Рисунок 5) и микроскопию визуализации времени жизни флуоресценции ( FLIM ), но эти методы также могут вводить другие ограничения.Метод фотообесцвечивания акцептора используется для определения эффективности FRET путем измерения величины подавленного донорного сигнала (рис. 5 (а)) в присутствии акцептора с последующим измерением ослабленного донорного сигнала после того, как флуоресценция акцептора была разрушена посредством фотообесцвечивание (рис. 5 (б) и 5 ​​(в)). Основная концепция фотообесцвечивания акцептора FRET заключается в том, что флуоресценция донора тушится в результате резонансной передачи энергии акцептору. В результате фотообесцвечивание акцептора увеличивает флуоресценцию донора из-за потери эффекта тушения.Таким образом, если FRET происходит между донором и акцептором, флуоресценция донора должна увеличиваться, когда акцептор эффективно удаляется после фотообесцвечивания. Одним из преимуществ фотообесцвечивания акцепторов является то, что каждая исследуемая клетка служит своим собственным контролем, что делает этот метод одним из самых точных для измерения FRET.

Основная задача при выполнении измерений FRET фотообесцвечивания акцептора заключается в том, чтобы убедиться, что донор также не подвергается фотообесцвечиванию, и что акцептор фотообесцвечивается (по крайней мере) примерно до 10 процентов от его исходного значения.Любое фотообесцвечивание донора приведет к недооценке эффективности FRET из-за потери сигнала. Кроме того, поскольку акцептор необратимо фотообесцвечивается (фактически разрушается), методика фотообесцвечивания акцептора не может быть повторена на одной и той же ячейке. Кроме того, из-за высокой фотостабильности, которую демонстрируют многие флуоресцентные белки, фотообесцвечивание акцептора может занять несколько минут и менее полезно для динамических измерений в живых клетках. Измерения фотообесцвечивания акцептора также могут быть скомпрометированы, если вся ячейка не будет отбелена за один этап.Фотообесцвечивание выбранной области цитоплазмы позволяет притоку свежих флуорофоров в обесцвеченную область, что увеличивает время, необходимое для обесцвечивания всех акцепторных молекул в клетке. Помимо этих проблем, фотообесцвечивание акцептора по-прежнему широко используется для определения эффективности FRET и обеспечивает отличный контроль после проведения экспериментов, основанных на альтернативных методах.

Мониторинг времени жизни донорной флуоресценции в экспериментах FRET можно использовать, чтобы избежать многих проблем, часто встречающихся при методиках фотообесцвечивания акцепторов.FLIM, пожалуй, самый строгий метод, используемый для измерения FRET, и он менее склонен к просачиванию артефактов, поскольку измеряет только колебания флуоресценции донора. Все флуорофоры, включая флуоресцентные белки, демонстрируют экспоненциальное затухание их флуоресцентного излучения, которое можно измерить в наносекундной шкале времени. Скорость этого экспоненциального затухания чувствительна к любым процессам, влияющим на возбужденное состояние, включая множество переменных окружающей среды, которые могут гасить флуоресценцию.Таким образом, основная концепция, связанная с FLIM, связана с фотообесцвечиванием акцептора в том смысле, что его можно использовать для обнаружения изменений времени жизни донорной флуоресценции, которые сопровождают передачу энергии акцептору. Фактически, флуоресценция донора гасится FRET, и степень этого гашения может быть определена путем измерения изменений времени жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора.

Комбинация FLIM с FRET может облегчить проблемы с артефактами прямого возбуждения акцептора, которые усложняют другую методологию, и этот метод также можно использовать для мониторинга FRET с использованием акцепторов, которые сами по себе не являются флуоресцентными.Однако у FLIM есть ограничения, которые не позволяют ему стать самым популярным методом для получения изображений FRET. Главное соображение заключается в том, что наносекундные измерения срока службы чрезвычайно сложны и должны проводиться с использованием дорогостоящих приборов, которые не широко доступны. Кроме того, FLIM часто требуется несколько минут для сбора каждого изображения, что сильно ограничивает его применение для быстрых динамических событий. Еще одно осложнение - это многоэкспоненциальные кривые спада времени жизни, которые обычно встречаются у многих флуорофоров, которые обычно требуют более всеобъемлющих стратегий сбора данных и усложняют анализ FRET.Наконец, измерения FLIM чувствительны к факторам окружающей среды за пределами FRET, которые могут сократить измеряемый срок службы, включая автофлуоресценцию, вязкость, изменения pH и присутствие ионов металлов. Все только что описанные переменные снижают эффективность использования только методов акцепторного фотообесцвечивания и FLIM, однако они представляют собой важные средства контроля для проверки измерений FRET, полученных другими методами.

Самый простой и простой метод измерения FRET известен как сенсибилизированное излучение (в литературе обычно называется двухцветным ратиометрическим изображением ; см. Рисунок 6), который может быть выполнен на стандартном широкоугольном микроскопе, оборудованном соответствующей флуоресценцией. наборы фильтров.При сенсибилизированной эмиссии донорный флуорофор возбуждается определенной полосой длин волн, и сигнал собирается с использованием двух наборов эмиссионных фильтров, настроенных на флуоресценцию донора или акцептора. Этот метод может дать результаты очень быстро (ограниченный только ограничениями переключения колес фильтров) и поэтому весьма полезен при динамической визуализации живых клеток. В том маловероятном случае, когда не происходит просачивания между возбуждением и испусканием двух флуорофоров, сенсибилизированное излучение будет преобладающим методом измерения FRET.К сожалению, просачивание обычно является значительной проблемой, особенно при использовании флуоресцентных белков, а сенсибилизированное излучение требует обширных контрольных экспериментов, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Кроме того, эти элементы управления должны подвергаться значительной обработке изображения, чтобы вычесть проступание, ограничение, которое замедляет время сбора данных, увеличивает уровень шума и вносит относительно высокую степень неопределенности в измерения.

На рисунке 6 представлена ​​серия изображений, полученных при широкоугольном флуоресцентном освещении кальциевых волн, пересекающих цитоплазму клеток карциномы человека ( HeLa ), экспрессирующих циркулярно пермутированный вектор камелеона YC3.60. Этот биосенсор содержит варианты ECFP и EYFP, которые соединяют белок кальмодулин и кальций-кальмодулин-связывающий домен киназы легкой цепи миозина ( M13 ) в линейной химере. В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками. На рисунке 6 (а) представлено реальное цветное изображение двух соседних клеток перед добавлением гистамина для индукции связывания кальция с биосенсором.На рисунках с 6 (b) по 6 (h) показаны изображения в псевдоцветном соотношении кальциевых волн, распространяющихся через цитоплазму двух клеток HeLa. Обратите внимание, что волна распространяется сверху вниз в верхней ячейке и справа налево в нижней ячейке. Общее время прохождения кальциевой волной цитоплазмы в этих клетках составляло приблизительно 1,5 секунды. Уровень FRET указывается путем сравнения логометрических псевдоцветов с легендой, представленной на рисунке 6 (а). Изображения на рисунке 6 были получены с использованием двухдиапазонного дихроматического светоделителя, соединенного с фильтрами возбуждения и излучения, настроенными на оптимальные диапазоны длин волн для визуализации ECFP и EYFP с минимальным просачиванием.

Был описан ряд корректирующих подходов для сенсибилизированного излучения с использованием нескольких различных комбинаций фильтров с контролями, которые содержат только донор, только акцептор или образец FRET как с донором, так и с акцептором. Элементы управления позволяют исследователю определить уровень просачивания возбуждения и излучения и вычесть его из измерения FRET. Однако из-за всех необходимых поправочных коэффициентов количество шума в окончательном FRET-изображении может превышать уровень сенсибилизированного излучения в ситуациях, когда взаимодействие между донором и акцептором является слабым.Спектральная визуализация в измерениях FRET

В приложениях FRET построение спектральных изображений можно рассматривать как разновидность метода сенсибилизированного излучения, основанного на возбуждении только донора с последующим получением всего спектра излучения как донорной, так и акцепторной флуоресценции вместо сбора данных по двум независимым каналам. До появления лазерных сканирующих конфокальных микроскопов, предназначенных для получения спектральных изображений, методика в основном ограничивалась спектроскопическими экспериментами с использованием кювет и очищенных флуорофоров.Спектральная визуализация FRET предполагает, что сбор всего спектра флуоресценции позволит разделить перекрывающиеся спектральные профили в соответствии с различными формами спектров, а не просто контролировать интенсивность излучения в ограниченной области полосы пропускания с использованием фильтра. Таким образом, собирая весь спектр как от донора, так и от акцептора (см. Рисунок 7 (a)), можно с помощью спектральной визуализации определить уровни флуоресценции донора и акцептора и на основе этой информации (в сочетании с контролями) вычислить эффективность FRET.

На фиг. 7 представлено логометрическое измерение спектрального изображения для флуоресцентного белкового биосенсора кальция, известного как cameleon YC3.60, как описано выше. Спектральные профили YC3.60 в присутствии (красная кривая; рис. 7 (а)) и отсутствии (желтая кривая) кальция демонстрируют высокий динамический диапазон зонда при 530 нанометрах. Рисунки биосенсора Cameleon представлены в присутствии (Рисунок 7 (b)) и в отсутствие (Рисунок 7 (c)) кальция, чтобы проиллюстрировать, как щелочной металл вызывает конформационные изменения в M13, чтобы переместить две флуоресцентные белковые части ближе друг к другу. .Лямбда-стек изображений с 10-нанометровыми интервалами клеток, экспрессирующих камелеон в присутствии высокой концентрации кальция, показан на рисунке 7 (d). Обратите внимание, что самые высокие интенсивности наблюдаются для лямбда-плоскости, содержащей длины волн излучения от 530 до 540 нанометров.

Сравнение спектрального изображения с линейным несмешиванием и сенсибилизированного излучения с двумя длинами волн возбуждения для определения FRET показывает, что отношение сигнал / шум для методов сенсибилизированного излучения ниже, чем у спектрального изображения (хотя это не всегда так и зависит от сильно зависит от параметров и конфигурации прибора).Это несоответствие связано с тем, что фильтры излучения с относительно узкой полосой пропускания, необходимые для отделения излучения от близко перекрывающихся флуорофоров, блокируют большинство используемых фотонов, которые в противном случае обнаруживаются с помощью спектральной визуализации. Отказ от большого количества выбросов приводит к значительной потере информации, которая в некоторых случаях приближается к 50 процентам имеющихся данных. Кроме того, спектральная визуализация обеспечивает оптимальное взвешивание в соответствии с шумом, присутствующим в отдельных каналах данных, в отличие от традиционных методов (часто отбрасываемых произвольно).Спектральная визуализация требует предварительного определения уровня просачивания из-за прямого возбуждения акцептора, но метод может выиграть от использования двух длин волн возбуждения с инструментами, которые так оснащены.

Конфокальные микроскопы

для получения спектральных изображений, оснащенные акустооптическими настраиваемыми фильтрами ( AOTF ) и специализированными детекторными системами, могут использоваться для получения серии изображений в дискретных ограниченных диапазонах длин волн для генерации так называемых лямбда-сумм (изображения боковых ( x, y ) как функция длины волны).Спектральные сигнатуры ( эмиссионных отпечатков ) для отдельных флуорофоров или флуоресцентных белков и загрязняющих фоновых сигналов (таких как автофлуоресценция) получают в результате деконволюции лямбда-стопок. Метод линейного разделения может применяться к лямбда-сумме для разделения вкладов отдельных сигналов флуорофора в каждый пиксель полученного изображения. Таким образом, спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием может определять и устранять вклад просачивания донора в сигнал FRET.Однако из-за того факта, что флуоресцентное излучение, вызванное прямым возбуждением акцептора (называемое просачиванием акцептора, см. Выше), идентично по спектральным характеристикам сигналу флуоресценции, производимому FRET, необходимо разработать элементы управления, которые помогают определить и устранить вклад акцепторного просачивания, чтобы получить эффективность FRET. Спектральную визуализацию также можно комбинировать с фотообесцвечиванием акцептора или использовать для изучения динамических изменений эффективности FRET в флуоресцентных белковых биосенсорах без использования контроля.Последняя стратегия, пожалуй, наиболее широко применяемый метод исследования FRET с помощью спектральной визуализации.

Для устранения просачивания спектрального излучения акцептора из-за перекрестного возбуждения в приложениях FRET для получения спектральных изображений большинство подходов основано на предположении, что при отображении в идентичных условиях динамика этих артефактов будет по существу одинаковой в контрольных ячейках, которые экспрессируют только акцептор (по сравнению с экспериментальными клетками, которые экспрессируют как донор, так и акцептор).Однако из-за того, что разные ячейки используются для определения вклада проступания в экспериментальных ячейках, отдельные местоположения пикселей нельзя сравнивать напрямую. В большинстве случаев можно сравнить пиксели как в контрольных, так и в экспериментальных клетках, которые имеют совпадающие уровни флуоресценции. Этот метод основан на алгоритме, который определяет уровни флуоресценции пиксель за пикселем и устанавливает уровень проступания в контрольных клетках, которые экспрессируют только акцептор.Эти контрольные значения проступания затем применяются в качестве поправочного коэффициента к соответствующим совпадающим пикселям в экспериментальных ячейках, которые выражают как донорные, так и акцепторные флуорофоры.

В парах FRET флуоресцентных белков, которые сконструированы с вариантами голубого и желтого флуоресцентных белков (ECFP и EYFP), для получения спектрального изображения требуется возбуждение голубого варианта с использованием лазерной спектральной линии, которая перекрывается с профилем поглощения флуоресцентного белка. В современных конфокальных микроскопах используются диодные и газовые лазеры со спектральными линиями 405, 440 и 458 нанометров, каждый из которых полезен для возбуждения голубых флуоресцентных белков.Однако спектральная линия длиной 458 нм от аргон-ионного газового лазера приводит к значительному просачиванию акцептора (примерно 20 процентов) в канал FRET для пар ECFP-EYFP. Напротив, диодные лазеры с длиной волны 405 и 440 нм будут генерировать меньше проступания (примерно 4 и 8 процентов, соответственно), но загрязняющий сигнал от прямого акцепторного возбуждения все равно должен быть удален для точного расчета сигнала FRET. После установления соотношения интенсивностей изображения донора в присутствии ( I DA ) и отсутствии ( I D ) акцептора эффективность FRET может быть определена с помощью следующего соотношения:

E FRET = 1 - (I DA / I D )

Расчет эффективности FRET таким образом был подтвержден с использованием пар флуоресцентных белков FRET, которые были слиты вместе с короткими пептидными линкерами, а также гораздо более сложной задачи исследования FRET между зондами, которые экспрессируются отдельно.Результаты показали очень похожие значения эффективности FRET при сравнении спектральной визуализации с методологией, основанной на интенсивности, и методологией FLIM. Однако спектральная визуализация позволяет избежать потенциальных проблем, связанных с просачиванием акцепторного сигнала в донорный канал, что является обычным явлением для сенсибилизированного излучения на основе фильтров и визуализации с многофотонным возбуждением. Следует обратить внимание на то, что компонент спектрального просвечивания акцептора часто является незначительным и может создавать проблемы при количественной оценке уровня сигнала при использовании детекторов с фотоумножителями, которые имеют нестабильный отклик при очень низких значениях интенсивности.Этот артефакт можно преодолеть, определив просачивание на разных уровнях интенсивности в контрольных ячейках.

Перекрестного возбуждения акцептора можно избежать, выбирая пары FRET флуоресцентного белка, у которых есть донор с большим стоксовым сдвигом. Например, mT-Sapphire и mAmetrine являются производными GFP, которые поглощают свет в ультрафиолетовых длинах волн (приблизительно 400 нанометров), но излучают либо в зеленой (510 нанометров), либо в желтой (530 нанометров) областях спектра.Когда эти доноры сочетаются с оранжевыми или красными флуоресцентными акцепторами белка, возбуждение пары FRET вызывает скудное просачивание акцептора и не требует никаких поправочных факторов или контролей. Например, соединение производной GFP, известной как GFP2, с EYFP привело к образованию пары FRET, которая может быть возбуждена с помощью 405-нанометрового диодного лазера и успешно наблюдаться с помощью спектральной визуализации. Поскольку GFP2 и EYFP имеют сильно перекрывающиеся спектры излучения, линейное разделение данных FRET позволяет определить вклад каждого флуорофора в общее излучение флуоресценции.Аналогичным образом, связывание мАметрина с тандемно-димерным томатом (tdTomato) дает пару FRET, которая излучает оранжево-красную флуоресценцию при возбуждении на 405 нм. Возбуждение только tdTomato на этой длине волны практически не дает детектируемого сигнала, поэтому при использовании этой пары поправка на просачивание акцептора не требуется. Подобные пары FRET, вероятно, дадут идентичные результаты.

Из-за неспособности конфокальной микроскопии спектральной визуализации различать эмиссионный сигнал акцептора, генерируемый посредством FRET, и сигнал, происходящий от прямого возбуждения акцептора в флуоресцентном белке и других парах флуорофоров, которые имеют сильно перекрывающиеся спектральные профили, необходимые для FRET, несколько исследователей объединили спектральная визуализация с использованием методов фотообесцвечивания акцепторов для определения эффективности FRET.На рисунке 8 показан пример спектральной визуализации флуоресцентных белков с фотообесцвечиванием акцептора для анализа FRET. Флуорофор представляет собой химеру mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. При экспрессии в клетках млекопитающих (почки кролика) вектор слияния распространяется по цитоплазме и проникает в ядро. Спектральное изображение выраженного вектора в клетках, полученное от 450 до 650 нанометров, представлено на рисунке 8 (а), а изображения эмиссии mCerulean и mVenus с разрешенным спектром показаны на рисунках 8 (b) и 8 (c), соответственно.После фотообесцвечивания mVenus в ячейке, показанной в нижней части окна светом 514 нанометров (Рисунок 8 (f)), флуоресцентное излучение mCerulean увеличивается (Рисунки 8 (d) и 8 (e)) как следствие донорства. обезвоживание.

Фотообесцвечивание акцептора обычно достигается с помощью лазерной спектральной линии, которая перекрывает область с высоким коэффициентом экстинкции (как можно ближе к пику) в спектре поглощения акцептора. Например, в комбинации ECFP-EYFP FRET для фотообесцвечивания EYFP обычно используется 514-нанометровая аргонно-ионная лазерная линия, тем самым уменьшая гашение ECFP с последующим увеличением донорного сигнала (рисунки 8 (d) -8 (f)).Поскольку EFYP постепенно фотообесцвечивается, лямбда-сканирование спектрального изображения проводится с использованием линии аргон-ионного лазера длиной 548 нанометров (возбуждающий ECFP) между каждым событием фотообесцвечивания для регистрации изменений спектрального отклика. Как правило, лямбда-пакеты собираются в диапазоне длин волн от 465 до 600 нанометров в дискретных полосах пропускания (приблизительно 10 нанометров). Этот экспериментальный подход разработан для минимизации ошибки отдельных измерений путем подгонки изменений интенсивности к стандартной кривой.Значения максимального увеличения интенсивности ECFP можно затем экстраполировать из этой кривой, даже если EYFP никогда не подвергается фотообесцвечиванию полностью. Конечная цель - избежать повреждения живых клеток и нежелательного фотообесцвечивания ECFP в ходе эксперимента. Методы фотообесцвечивания акцептора дают оптимальные результаты, когда донор является фотостабильным, а акцептор - фотолабильным. Эту ситуацию можно контролировать, выбирая подходящие варианты флуоресцентного белка, такие как Cerulean и Venus.

Чтобы рассчитать эффективность FRET с использованием метода фотообесцвечивания акцептора, необходимо выполнить ряд шагов в стратегии анализа данных. Первый шаг состоит из линейного разделения компонентов ECFP и EYFP (или других флуорофоров, если они используются вместо них). Затем за измерением средней интенсивности доноров ECFP и акцепторов EYFP следует расчет изменений интенсивностей для определения эффективности FRET. После получения стопок лямбда используется линейное размешивание для создания изображений донора ECFP и акцептора EYFP из стопок.Общий успех линейного разделения зависит от наличия образцов, которые демонстрируют хорошее отношение сигнал / шум, и использования эталонных спектров, которые точно представляют спектры, содержащиеся в образце FRET. В большинстве случаев клетки, экспрессирующие только ECFP или EYFP (контроль), используются для генерации эталонных спектров. Контрольные спектры должны быть получены в тех же условиях, что и для образца FRET, включая настройки усиления, смещение, диапазон длин волн, объектив и дихроматическое зеркало. Изображения должны быть получены с минимальной насыщенностью сигнала и минимальной интенсивностью пикселей, установленной чуть выше нуля, чтобы получить максимально возможный динамический диапазон.После вычитания фона эффективность FRET рассчитывается с использованием приведенного выше уравнения, где ( I DA ) и ( I D ) представляют собой нормированные интенсивности донора до и после 100-процентного фотообесцвечивания акцептора. В связи с тем, что EYFP почти никогда не обесцвечивается полностью, значение для ( I D ) обычно экстраполируется из линейной аппроксимации графика, описывающего процентное увеличение выбросов ECFP по сравнению с процентным уменьшением EYFP.Технику фотообесцвечивания акцептора можно использовать с другими парами флуоресцентных белков (такими как EGFP и mKusabira Orange) аналогичным образом.

Уникальный подход к измерению FRET с помощью спектральной визуализации, получивший название lambda FRET , оказался высокоспецифичным, чувствительным и надежным методом анализа резонансной передачи энергии в живых клетках. Алгоритм лямбда FRET основан на отображении образца FRET на нескольких длинах волн излучения с последующим разделением спектра FRET на его донорные и акцепторные компоненты для получения пиксельного расчета эффективности FRET.Lambda FRET применяет новую процедуру предварительной калибровки для коррекции спектрального просвечивания, основанную на получении эталонных отраженных изображений, и была подтверждена с использованием синтетических флуорофорных стандартов FRET (таких как Alexa Fluor 488 и Cy3), а также слияния флуоресцентных белков. (ECFP и EYFP) с переменной длиной линкера и стехиометрией. Уникальная процедура коррекции, основанная на использовании отраженных изображений для нормализации для различной интенсивности излучения, в принципе аналогична методам сенсибилизированного излучения, но дает результаты с меньшим шумовым загрязнением.Было продемонстрировано, что лямбда FRET полезна в случаях, когда высокое спектральное перекрытие и артефакты автофлуоресценции присутствуют как в сценариях визуализации фиксированных, так и живых клеток.

Помимо изучения межмолекулярных взаимодействий и определения эффективности FRET с использованием методов фотообесцвечивания акцепторов и коррекции просвечивания, спектральная визуализация была очень полезна для исследования флуоресцентных белковых биосенсоров для определения наличия или отсутствия FRET в ответ на биологический стимул. .Методология требует получения спектра биосенсора в присутствии и в отсутствие стимулятора, чтобы определить, наблюдается или устраняется FRET, и контролировать динамический диапазон ответа (см. Рисунок 7). Таким образом, творчески объединив пары флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов или другой биологической активности, ряд исследователей разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для визуализации важных оптических живых клеток. метаболические и сигнальные процессы.Обычно два флуоресцентных белка (обычно голубой и желтый варианты) вставляются на противоположных концах сенсорного белка или пептидной последовательности (см. Фиг. 9), как кратко описано выше. Изменения в конформации сенсорного белка вызывают соответствующие третичные изменения в структурной организации комплекса и, таким образом, в уровне FRET, который может наблюдаться между фланкирующими флуоресцентными белками. Ратиометрическое изменение выхода флуоресценции донора и акцептора с использованием одного параметра возбуждения в сочетании со спектральной визуализацией становится популярной методологией для исследования этих биосенсоров.

На рисунке 9 представлена ​​карикатура, иллюстрирующая общие стратегии построения флуоресцентных белковых биосенсоров. Голубые цилиндры представляют собой CFP, серые цилиндры представляют собой YFP без FRET, а желтые цилиндры представляют YFP с FRET. Синие молнии указывают на возбуждение на 450 нм, а параллельные волны - на флуоресцентное излучение (на 475 нм, голубой; или 530 нм, желтый). Сенсорные домены имеют телесный цвет, а эффекторные агенты - сферы или эллипсы. На рисунке 9 (a) показан межмолекулярный FRET между отдельным сенсорным доменом и субстратом, слитым с CFP и YFP, соответственно, а на рисунке 9 (b) изображен флуоресцентный белковый биосенсор с одним сенсорным доменом и эффекторным лигандом.Связывание субстрата с сенсорным доменом на рисунке 9 (a) вызывает FRET, тогда как связывание лиганда на рисунке 9 (b) вызывает конформационные изменения в сенсорном домене, чтобы привести флуоресцентные белки в правильную близость для передачи энергии (см. Также Рисунки 7 (б) и 7 (в)). В некоторых случаях домены субстрата и сенсорного белка связаны (рисунок 9 (c)) для создания единой генетической единицы экспрессии для внутримолекулярного FRET, в отличие от ситуации на рисунке 9 (a). Флуоресцентный белковый биосенсор, который обнаруживает расщепление субстрата (рис. 1 и рис. 9 (d)), работает путем устранения FRET после того, как соответствующая протеаза была индуцирована.Биосенсоры протеазного расщепления являются популярными индикаторами апоптоза.

За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих различные пары FRET. Несмотря на ограничения динамического диапазона, наблюдаемые в некоторых биосенсорах FRET, использующих производные голубого и желтого цветов, использование этих флуоресцентных белков получило широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений, широкой доступности и простоты сравнения с другими датчиками, имеющими аналогичные свойства. .Начинают появляться альтернативные пары FRET, включая голубые и бирюзовые донорные флуоресцентные белки, связанные с желтыми и оранжевыми акцепторными флуоресцентными белками, а также зеленые флуоресцентные доноры белков, связанные с красными флуоресцентными белками-акцепторами. Однако на сегодняшний день полезность флуоресцентных белков, полученных из рифовых кораллов и морских анемонов, ограничена. Несколько многообещающих биосенсоров сопоставляют сапфировое или желтое производное GFP с красным флуоресцентным белком для получения репортера длинного стоксова сдвига, как обсуждалось выше.Без сомнения, появятся усовершенствованные биосенсоры с использованием более точно настроенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов. С этой целью спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием будет по-прежнему рассматривать увеличение нагрузки как один из методов выбора для анализа FRET.

Выводы

Ряд методов был разработан для анализа FRET в флуоресцентных белках, а также в синтетических красителях и квантовых точках.Для визуализации живых клеток спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием обеспечивает надежный метод измерения FRET с использованием флуорофоров с сильно перекрывающимися спектральными профилями, что обычно встречается с образцами FRET. Новые флуоресцентные белковые биосенсоры обещают расширить горизонты динамических исследований субклеточной активности, и спектральная визуализация должна оказаться очень полезным инструментом в этой области. Для дальнейшего совершенствования аналитических методов спектральную визуализацию можно комбинировать с методами фотообесцвечивания на протяжении всего срока службы или акцептора.Кроме того, возможность проведения экспериментов FRET с использованием двух разных акцепторов (имеющих разные спектры излучения) находится в пределах области спектральной визуализации, но гораздо труднее выполнять с использованием традиционной методологии.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (более известный как FRET) позволяет обнаруживать приближение между двумя молекулами в пределах нескольких нанометров.

Это зависящее от расстояния взаимодействие достаточно близко, чтобы позволить происходить молекулярным реакциям, и поэтому может предоставить информацию о потенциальных взаимодействиях между мечеными молекулами внутри клетки.

Содержание

Введение в FRET

Флуоресценция - это световой сигнал, который мы можем обнаружить, когда флуорофор поглощает энергию на определенной длине волны и возбуждается, чтобы излучать свет на более высокой длине волны, когда он возвращается в свое основное состояние.

Во время FRET донорный флуорофор возбуждается источником света и передает свою энергию ближайшему акцепторному флуорофору. Акцепторный флуорофор поглощает энергию, чтобы произвести детектируемый сигнал светового излучения.Этот процесс приводит к потере флуоресценции донора и усилению флуоресценции акцептора, оба из которых могут быть измерены.

Для возникновения FRET должны быть выполнены несколько условий:

  • Близость . Донорные и акцепторные флуорофоры должны быть близко друг к другу, чтобы процесс FRET был эффективным. Эффективность FRET (E) определяется уравнением E = Ro6 / (Ro6 + r6), где Ro - радиус Ферстера, а r - фактическое расстояние между двумя флуорофорами.Радиус Ферстера - это расстояние, на котором 50% энергии возбуждения передается от донора к акцептору, а значение Ro обычно находится в пределах 10–100 Å (1–10 нм). Пары FRET со значением Ro ближе к верхнему пределу этого диапазона часто предпочтительны из-за повышенной вероятности появления FRET.
  • Спектральное перекрытие . Спектр излучения донорного флуорофора должен перекрывать спектр поглощения акцепторного флуорофора. Чем больше степень спектрального перекрытия, тем больше вероятность возникновения FRET.
  • Ориентация диполя . Передача энергии от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору происходит посредством межмолекулярного диполь-дипольного взаимодействия. Пространственная связь между дипольным моментом излучения донора и дипольным моментом поглощения акцептора описывается коэффициентом ориентации ĸ2, который имеет значения от 0 (все диполи перпендикулярны) до 4 (все диполи параллельны). Ориентация диполя между двумя флуорофорами обычно считается случайной из-за быстрого вращения молекул и принимается равной статистическому среднему (значение 2/3) для большинства расчетов Ro.

Применение технологии FRET

FRET - чрезвычайно мощный метод определения потенциальных молекулярных взаимодействий, который может использоваться в таких методах, как проточная цитометрия, иммуноцитохимия, иммуногистохимия и ELISA. FRET также идеально подходит для высокопроизводительного скрининга (HTS), поскольку он прост, чувствителен и легко автоматизируется.

Одним из популярных способов использования FRET является идентификация взаимодействия между двумя биомолекулами, например связывание лиганда с рецептором; сигнал FRET может быть обнаружен только тогда, когда биомолекулы находятся в непосредственной близости в силу события связывания.

FRET полагается на использование высококачественных реагентов с маркировкой. В зависимости от предполагаемой схемы анализа это могут быть антитела, белки или пептиды.

Оптимальные пары флуорохромов для FRET

Мы определили следующие оптимальные пары FRET, которые можно найти в нашем ассортименте антител, созданных с помощью наборов для конъюгации Lightning-Link® или изготовленных с помощью наших специализированных служб конъюгации, чтобы обеспечить полную гибкость анализа:

  • RPE-APC
  • RPE-Cy5
  • RPE-Cy5.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *